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Jul 31, 2023

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 11791 (2023) Cite este artículo 163 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics En este estudio, el sistema isotérmico mediado por bucle SalivaDirect no controlado eléctricamente

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11791 (2023) Citar este artículo

163 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

En este estudio, se desarrolló la amplificación isotérmica mediada por bucle SalivaDirect no controlada eléctricamente (NEC-SD-LAMP), que puede detectar infecciones amplificando la expresión del ADN viral en la saliva sin utilizar sistemas de control eléctrico. Mediante este método, solo agregando agua al dispositivo, se extrajo ADN viral de la saliva usando SalivaDirect, el ADN extraído se amplificó mediante amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y los resultados se confirmaron visualmente. La fusión del ácido palmítico mantuvo la temperatura óptima para la reacción LAMP, ya que la temperatura del ácido palmítico se mantiene en 62,9 °C, su punto de fusión. Aprovechando la proximidad del punto de fusión a la temperatura óptima para LAMP, LAMP se puede utilizar sin electricidad. Detectamos varios virus en la saliva utilizando este método. NEC-SD-LAMP pudo distinguir claramente 3 tipos de ADN viral, lo que indica la alta especificidad de esta reacción. Además, el límite de detección de concentración viral del dispositivo fue de 2 copias por µL, lo que indica que es posible detectar infecciones virales de ADN en la saliva incluso antes del inicio de la infección viral.

Las enfermedades infecciosas son las principales causas de muerte en los países en desarrollo1,2. Una razón es la falta de técnicas de diagnóstico de agentes infecciosos. Una causa más grave es la dificultad para acceder a instalaciones médicas adecuadas3. Esto reduce las posibilidades de realizar pruebas, lo cual es importante para el diagnóstico de infecciones virales. La detección y el tratamiento tempranos de las infecciones virales son fundamentales para lograr curas completas y prevenir su propagación. Además, las enfermedades infecciosas, como las enfermedades tropicales desatendidas, prevalecen en muchas áreas tropicales no electrificadas, lo que hace imposible instalar dispositivos de prueba convencionales que requieran control eléctrico, por lo que son importantes las técnicas de diagnóstico que no requieren infraestructura eléctrica ni un voltaje estable4. Por lo tanto, para suministrar tecnología de prueba a los países en desarrollo, es esencial establecer métodos que satisfagan los tres criterios siguientes: (1) todo el proceso desde las pruebas hasta la confirmación de los resultados se puede realizar sin utilizar sistemas de control eléctrico, (2) detección precisa de enfermedades infecciosas desde una etapa temprana, y (3) facilidad de uso y portabilidad que permite realizar pruebas en cualquier lugar, como en áreas residenciales o al aire libre, regiones tropicales o frías (pruebas en el punto de atención [POCT])5.

Se pueden utilizar varios dispositivos o métodos para realizar pruebas de enfermedades infecciosas en entornos no electrificados. En primer lugar, existen kits de pruebas de infección basados ​​en reacciones antígeno-anticuerpo, como la inmunocromatografía6,7. Al agregar muestras al kit, se puede realizar rápidamente una prueba de diagnóstico de enfermedades infecciosas y los resultados se pueden observar visualmente o usando un teléfono inteligente. Aunque estos dispositivos pueden realizar pruebas fácilmente, detectar infecciones en las primeras etapas de una enfermedad es difícil debido a los métodos de detección de proteínas empleados por estos dispositivos. Los ácidos nucleicos pueden amplificarse eficazmente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y son eficaces para detectar infecciones en una etapa temprana.

LAMP es un método de amplificación de genes isotérmico en el que los resultados se pueden observar visualmente8,9,10. Este método amplifica y detecta el gen objetivo calentando la muestra a una temperatura constante de 60 a 65 °C. LAMP utiliza cuatro o seis cebadores durante la amplificación, lo que tiene una alta especificidad para el gen objetivo. Cuando LAMP amplifica el gen diana, se producen iones pirofosfato. Los iones pirofosfato capturan los iones de manganeso contenidos en el complejo de iones calceína-manganeso en la muestra LAMP, lo que hace que la calceína se vuelva luminiscente. Como resultado, la presencia o ausencia del gen diana se puede observar visualmente mediante el cambio de color de la muestra11. De lo anterior, LAMP tiene alta especificidad y sensibilidad de detección, así como PCR en tiempo real y qRT-PCR12,13, que son los métodos estándar de oro para la detección viral. LAMP es un método fácil de usar para la detección viral en comparación con la PCR, ya que la reacción se puede realizar con un simple control de temperatura y los resultados se pueden confirmar visualmente.

Para realizar LAMP en un campo no electrificado se han utilizado calentadores de bolsillo desechables14,15,16,17,18,19. El método LAMP se puede realizar fácilmente colocando una muestra en calentadores de bolsillo desechables y los resultados se pueden confirmar visualmente, mostrando una portabilidad mejorada. Sin embargo, la temperatura de salida de este método es inestable porque la reacción se lleva a cabo utilizando calor de calentadores de bolsillo desechables, que se ven considerablemente afectados por la temperatura ambiental circundante, especialmente en regiones frías o tropicales. Además, no se consideró la extracción del gen diana de una muestra, podrían ser necesarios otros procesos de extracción.

En este estudio, desarrollamos un nuevo método práctico denominado "LÁMPARA SalivaDirect no controlada eléctricamente (NEC-SD-LAMP)", que puede extraer genes virales de la saliva, amplificar el ADN viral extraído y confirmar los resultados visualmente simplemente agregando agua. . Este método extrae ADN viral de la saliva utilizando SalivaDirect y amplifica genes virales utilizando LAMP, y la infección viral se puede confirmar a simple vista. En SalivaDirect, las proteínas virales de la saliva se desnaturalizan y desactivan añadiendo proteinasa K. Al mismo tiempo, la DNasa y la RNasa de la saliva se inactivan para que los genes virales de la muestra puedan conservarse de forma estable. Después de la reacción, la muestra se calentó a 95 °C durante 5 min para inactivar la proteinasa K, se detuvo la reacción y se extrajo el ADN viral de la saliva.20.

NEC-SD-LAMP utiliza un agente exotérmico y ácido palmítico para realizar las reacciones SalivaDirect y LAMP en un dispositivo de reacción que comprende un recipiente aislado. Dado que la reacción se realizó en un recipiente aislado, se pudo realizar sin verse afectada por la temperatura ambiental circundante. Cuando se añade agua al dispositivo NEC-SD-LAMP, el agente exotérmico dentro del dispositivo reacciona y se calienta a 95 °C. Este proceso finaliza la reacción de SalivaDirect. El calor producido por el agente exotérmico también se utiliza para fundir el ácido palmítico. Durante la transición de cualquier sustancia de líquido a sólido, su temperatura se mantiene en el punto de fusión de la sustancia. Aplicando esta propiedad, la temperatura del ácido palmítico fundido se fijó en el punto de fusión (62,9 °C) durante la transición del ácido palmítico de líquido a sólido. LAMP se realiza aprovechando la proximidad del punto de fusión del ácido palmítico a la temperatura óptima de la reacción LAMP.

Con base en estos principios, logramos calentar a aproximadamente 95 °C durante más de 5 minutos, lo cual es necesario para la inactivación de la proteinasa K, y a 60–65 °C durante más de 1 h, lo cual es necesario para LAMP. Este dispositivo es pequeño (20 × 16 × 14 cm) y se puede fabricar por menos de 20 dólares, y todos los componentes, excepto el agente exotérmico y el tubo de muestra con el que la muestra entra en contacto, se pueden reutilizar. Por lo tanto, este dispositivo es económico y portátil y puede usarse como POCT en países en desarrollo, incluidas regiones frías o tropicales. Cuando utilizamos este dispositivo para detectar ADN de adenovirus en la saliva, detectamos una concentración viral tan baja como 2 copias por µL. Además, pudimos detectar específicamente 3 especies de ADN viral. Estos resultados indican que el diagnóstico precoz de enfermedades infecciosas es posible utilizando este dispositivo.

La Figura 1a muestra el dispositivo NEC-SD-LAMP fabricado. El dispositivo constaba de un soporte sobre el que colocar un tubo de PCR con reactivos cuando se realizaba el SalivaDirect, un agente exotérmico, un recipiente de polipropileno (PP) que contenía ácido palmítico, un recipiente aislado al vacío (VI) utilizado durante la LAMP, un marco para determinar la posición de estos componentes, y un recipiente de poliestireno (PS) para contener todos estos componentes. El soporte y el marco se fabricaron con una impresora 3D. El soporte contenía múltiples orificios para la colocación del tubo de PCR, lo que permitía reacciones simultáneas de múltiples muestras (Fig. 1b). El soporte es extraíble y, utilizando otros soportes, podríamos cambiar el número de muestras en un experimento o realizar experimentos en tubos con otros volúmenes. Los agentes exotérmicos consistieron en CaO y Al. El contenedor de PP estaba hecho de una película de PP de 200 µm de espesor y se instaló dentro del contenedor VI cuando se realizó la fase LAMP (Fig. 1c). El contenedor de PS se formó combinando placas de poliestireno de 2,0 cm de espesor. La tapa del recipiente de PS tiene un orificio de 1,0 cm de diámetro, que sirve para liberar el hidrógeno y el vapor de agua generados durante el SalivaDirect al exterior del recipiente. Al realizar la reacción SalivaDirect, el contenedor de PS se cerró y aseguró usando una banda, y se montó un tapón de goma de cloropreno de 2,0 mm de espesor entre la tapa y el contenedor para sellar el contenedor.

El dispositivo NEC-SD-LAMP desarrollado. (a) Todos los componentes del dispositivo NEC-SD-LAMP. (b) Representar SalivaDirect. En este componente existen varios orificios en los que colocar los tubos de PCR. (c) Contenedor de polipropileno (PP). Los soportes para el tubo de PCR y el ácido palmítico están montados dentro de este contenedor.

La Figura 2 muestra el proceso de reacción en el dispositivo desarrollado. Durante la reacción de SalivaDirect, el soporte, el agente exotérmico y los recipientes de PP y VI (sin tapas) se colocaron en un recipiente de PS (Fig. 2a). Primero, se añadió proteinasa K a una muestra de saliva en un tubo de PCR, que luego se colocó en el soporte del SalivaDirect. Después de la reacción, se añadió agua Milli-Q al recipiente de PS y se cerró la tapa del recipiente de PS, iniciando las siguientes reacciones entre el agua Milli-Q y el agente exotérmico:

Mecanismo del dispositivo NEC-SD-LAMP. Estas figuras fueron creadas usando PTC Creo parametric ver. 8.0.4.0. (https://www.ptc.com/ja/products/creo/parametric). (a) Funcionamiento del ensayo SalivaDirect. En este método, la reacción exotérmica entre el agua Milli-Q y un agente exotérmico se realiza para detener SalivaDirect inactivando la proteinasa K. En este proceso, se disuelve el ácido palmítico en el recipiente de PP y se calienta el interior del recipiente aislado al vacío (VI). También se realizan contenedores. (b) Operación del ensayo LAMP. Durante la LAMP, el contenedor de PP se coloca dentro del contenedor VI y el tubo de PCR que contiene la muestra LAMP se coloca en el soporte del contenedor de PP. La reacción se lleva a cabo aplicando el calor de transición del ácido palmítico a medida que pasa de líquido a sólido.

El calor generado por esta reacción se utilizó para detener SalivaDirect mediante la inactivación de la proteinasa K, derretir el ácido palmítico en el recipiente de PP y calentar el interior del recipiente VI.

LAMP se realizó después de SalivaDirect. Para la LAMP, el contenedor de PP se colocó en el contenedor VI (Fig. 2b). Luego se añadió la muestra post-SalivaDirect al reactivo LAMP en un tubo de PCR y se colocó en un soporte en el contenedor de PP. Se cerró la tapa del contenedor VI y la LAMP procedió. La temperatura en el recipiente de PP se puede mantener a 62,9 °C, el punto de fusión del ácido palmítico, hasta que todo el ácido palmítico en el recipiente de PP pase de líquido a sólido. Debido a que la reacción se realiza en un recipiente VI, es posible mantener la temperatura del ácido palmítico y lograr una reacción uniforme independiente de la temperatura ambiental circundante. Después de la reacción, el ácido palmítico solidificado se puede reutilizar retirando el recipiente de PP del recipiente VI y recalentándolo. Esta estructura de contenedor dual permite el uso repetido sin cambiar ningún componente del dispositivo excepto el agente exotérmico. Este proceso permite la detección de infecciones virales sin utilizar ningún sistema de control eléctrico.

La Figura 3a muestra el cambio de temperatura dentro del contenedor de PS durante la reacción exotérmica. Se agregaron 150 ml de agua Milli-Q al recipiente de PS con el agente exotérmico colocado en el fondo. La temperatura en cada momento se calculó utilizando la resistencia de un termistor colocado en el costado del contenedor de PS. Como se muestra en la Fig. 3a, esta reacción podría calentar el recipiente a 94,8 °C durante más de 5 minutos. Esta temperatura y este tiempo de reacción son suficientes para inactivar la proteinasa K. También confirmamos que todo el ácido palmítico en el recipiente de PP podría derretirse calentándolo.

Cambios de temperatura durante cada proceso de calentamiento. Las gráficas muestran la temperatura en el recipiente en cada momento. (a) Cambio de temperatura en el contenedor de PS durante la reacción exotérmica. (b) Cambio de temperatura del ácido palmítico en el recipiente de PP durante la LAMP.

La Figura 3b muestra el cambio de temperatura del ácido palmítico en el recipiente de PP. Este experimento verificó el cambio de temperatura en el ácido palmítico derretido después de colocar el recipiente de PP en el recipiente VI después de la reacción exotérmica. La temperatura en cada momento se calculó utilizando la resistencia de un termistor colocado en el costado del contenedor de PP. Como se muestra en la Fig. 3b, la temperatura del ácido palmítico en el recipiente de PP se mantuvo con éxito a 62,7 °C durante más de 1 h, lo que fue suficiente para realizar la LAMP.

La Figura 4 muestra los resultados de una prueba para detectar ADN viral en saliva utilizando el dispositivo desarrollado. La Figura 4a muestra el tubo de PCR después de NEC-SD-LAMP utilizando muestras de saliva mezcladas con ADN de adenovirus. Control negativo (NC) se refiere a NEC-SD-LAMP realizado con muestras de saliva sin ADN de adenovirus, Control positivo (PC) se refiere a SalivaDirect y LAMP realizados con muestras de saliva que contienen ADN de adenovirus de un ciclador térmico convencional, y Muestra se refiere a NEC- SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva que contienen ADN de adenovirus. Como se muestra en la Fig. 4a, el cambio de color de la solución de muestra fue visualmente similar al de la muestra de PC. Fue posible identificar las muestras bajo luz natural.

Experimento NEC-SD-LAMP para detectar ADN viral. Estas fotografías muestran las muestras en el tubo de PCR después de la reacción y se tomaron bajo irradiación de luz natural o de excitación. (a) Comparación funcional de NEC-SD-LAMP con un sistema convencional. “NC”, NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva sin ADN de adenovirus. Las reacciones “PC”, SalivaDirect y LAMP se realizaron utilizando muestras de saliva que contenían ADN de adenovirus en un ciclador térmico convencional. "Muestra", NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva que contenían ADN de adenovirus. (b) Verificación del límite de detección de NEC-SD-LAMP. “NC”, NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva sin ADN de adenovirus. (c) Análisis de la intensidad de fluorescencia de muestras que contienen cada concentración de ADN de adenovirus correspondiente utilizando el software ImageJ. El experimento se realizó tres veces y la intensidad de fluorescencia relativa de cada experimento se calculó en función de la intensidad de fluorescencia de la muestra NC. La media y la desviación estándar se muestran en el gráfico. (d) Verificación de la especificidad de NEC-SD-LAMP. “NC1”, NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva sin ADN de citomegalovirus ni ADN de adenovirus tipo 41. "NC2", NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva que contenían ADN de citomegalovirus o ADN de adenovirus tipo 41, y se utilizaron cebadores específicos de ADN adenoviral. "Muestra", NEC-SD-LAMP se realizó utilizando muestras de saliva que contenían ADN de citomegalovirus o ADN de adenovirus tipo 41, y se utilizó cada cebador de detección de ADN viral correspondiente.

Para confirmar que la reacción exotérmica detuvo la reacción de SalivaDirect, se realizó NEC-SD-LAMP en muestras en las que la proteinasa K no estaba inactivada. No se observó amplificación genética mediante la reacción LAMP en muestras que incluso contenían ADN de adenovirus (Sup. Fig. 1). Este resultado sugiere que cuando la proteinasa K no se inactiva lo suficiente, la enzima en el reactivo LAMP se inactiva y la reacción LAMP no se desarrolla correctamente. Estos resultados sugieren que la proteinasa K puede inactivarse suficientemente mediante una reacción exotérmica.

La película complementaria muestra una demostración en vídeo del uso de NEC-SD-LAMP. Como se muestra en la película complementaria, NEC-SD-LAMP se puede utilizar para extraer genes de la saliva y los resultados se pueden observar y verificar sin ningún sistema de control eléctrico.

El dispositivo NEC-SD-LAMP está diseñado para su uso en diversas áreas, incluidas regiones frías o tropicales. Para verificar si se podía realizar una reacción estable en regiones tropicales, instalamos el dispositivo en una incubadora (50 °C) y realizamos NEC-SD-LAMP. Se utilizó como muestra ADN de adenovirus que contenía saliva, que se detectó con éxito en la reacción de la incubadora a temperatura ambiente (Sup. Fig. 2). También realizamos NEC-SD-LAMP en un congelador (- 20 ° C) y logramos detectar ADN de adenovirus en la saliva (Sup. Fig. 3). Estos resultados indican que el sistema NEC-SD-LAMP puede realizar reacciones estables incluso en entornos de alta o baja temperatura.

La Figura 4b muestra los resultados de la verificación del límite de detección para determinar la concentración viral usando NEC-SD-LAMP. El tubo de PCR se muestra después de ejecutar NEC-SD-LAMP utilizando muestras de saliva que contienen ADN de adenovirus con concentraciones finales que oscilan entre 0 y 200 copias por µL. Como se muestra en la Fig. 4b, las muestras que contienen más de 2 copias por µL de ADN de adenovirus mostraron un cambio en el color de la solución en relación con la muestra NC (0 copias por µL). La Figura 4c muestra los resultados del análisis de intensidad de fluorescencia de las muestras que contienen cada concentración de virus utilizando el software ImageJ. El experimento se realizó tres veces y la intensidad de fluorescencia relativa de cada experimento se calculó en función de la intensidad de fluorescencia de la muestra NC. La media de cada muestra se muestra en el gráfico. Las barras de error en el gráfico indican la desviación estándar. Se realizó una prueba t entre los grupos de muestras NC y las muestras que contenían cada concentración de virus. Como se muestra en la Fig. 4c, se observó un aumento significativo en la intensidad de la fluorescencia en muestras que contenían 2 o más copias por µL de ADN de adenovirus. Por el contrario, se observó un ligero aumento en la intensidad de la fluorescencia en muestras que contenían 1 copia por µL. Estos resultados indican que este método puede detectar visualmente muestras que contienen más de 2 copias de ADN viral por µL. Si se puede realizar un análisis de intensidad de fluorescencia, es posible detectar concentraciones de virus tan bajas como 1 copia por µL.

Sorber. La Fig. 4 muestra los resultados del límite de detección para determinar la concentración viral cuando SalivaDirect y LAMP se realizaron utilizando un ciclador térmico convencional. Cuando se detectó ADN de adenovirus con el sistema convencional, fue posible confirmar visualmente un cambio de color de la solución de más de 1 copia por µL. Además, bajo irradiación de luz de excitación, se pudieron detectar más de 0,5 copias por µL, lo que muestra una sensibilidad de detección ligeramente mayor en comparación con el NEC-SD-LAMP.

También probamos la posibilidad de realizar NEC-SD-LAMP en un gran volumen de muestra utilizando un tubo de 1,5 ml, asumiendo la detección de muestras de saliva con concentraciones virales extremadamente bajas. El dispositivo NEC-SD-LAMP se puede equipar con un tubo de 1,5 ml cambiando el soporte (Sup. Fig. 4a, b), por lo que utilizamos un volumen de muestra cuatro veces mayor que el de un tubo de PCR. Como resultado, pudimos confirmar un cambio en el color de la solución hasta una concentración de virus de 0,5 copias por µL (Sup. Fig. 4c), lo que sugiere que NEC-SD-LAMP se puede realizar con solo un cambio en el soporte. , incluso para muestras grandes que requieren una gran cantidad de calor para realizar la reacción. Estos resultados muestran que NEC-SD-LAMP podría usarse para detectar virus en la saliva en concentraciones muy bajas.

La Figura 4d muestra los resultados del NEC-SD-LAMP realizado utilizando 3 especies de ADN viral. Se utilizaron muestras de saliva que contenían ADN de adenovirus tipo 41 o citomegalovirus. NEC-SD-LAMP se realizó utilizando cebadores específicos para adenovirus, adenovirus tipo 41 y citomegalovirus. Como se muestra en la Fig. 4d, se observaron cambios en el color de la solución cuando las muestras de saliva contenían la misma especie de virus que los cebadores utilizados. Estos resultados sugieren que NEC-SD-LAMP puede reaccionar específicamente contra el virus objetivo.

Al combinar SalivaDirect y LAMP, NEC-SD-LAMP se puede utilizar para detectar infecciones virales en muestras de saliva sin utilizar electricidad. Se realizaron experimentos de verificación utilizando 3 tipos de ADN viral. Es posible detectar secuencias de ADN viral no utilizadas en este estudio preparando con precisión las secuencias de cebadores correspondientes.

Debido a que el sistema NEC-SD-LAMP realiza reacciones en contenedores de PS y VI altamente aislados, no se ve afectado por las temperaturas ambientales. Los resultados de este estudio mostraron que las reacciones podrían llevarse a cabo a temperaturas ambiente tan bajas como -20 °C y tan altas como 50 °C. Sin embargo, al realizar pruebas en regiones tropicales, es necesario llevar al campo no sólo el dispositivo sino también los reactivos. Los reactivos convencionales son difíciles de usar porque deben almacenarse por debajo de -20 °C. Desde entonces se han desarrollado reactivos liofilizados que pueden almacenarse a temperatura ambiente21. Además, estos reactivos liofilizados ya se utilizan en la práctica (DryADD, Nippon Gene Co., Ltd., Tokio, Japón; https://www.nippongenematerial.com/dry_reagent/LAMP_Master_Mix.html). La combinación del sistema NEC-SD-LAMP con reactivos liofilizados permite realizar pruebas de campo en regiones tropicales.

NEC-SD-LAMP podría detectar genes virales en una concentración tan baja como 2 copias por µL. En el tubo de reacción de 1,5 ml, la concentración viral se pudo detectar hasta 0,5 copias por µL. Una de las causas de la pandemia de SARS-CoV-2 fue el número limitado de instalaciones disponibles para realizar pruebas, lo que impidió que los pacientes se realizaran las pruebas, lo que provocó la gravedad de los síntomas o la propagación de la infección. El sistema NEC-SD-LAMP no sólo es altamente sensible y capaz de detectar desde las primeras etapas de la infección, sino que también es portátil y puede realizarse con operaciones muy simples. Por tanto, cumple con todos los factores requeridos para POCT y puede ayudar a solucionar las causas de la pandemia. Además, el dispositivo NEC-SD-LAMP se puede fabricar a bajo coste. Los analizadores de ácido nucleico para LAMP se pueden proporcionar a bajo costo a diversas instalaciones de investigación y pequeños laboratorios mediante la realización práctica de NEC-SD-LAMP. El sistema NEC-SD-LAMP tiene potencial para hacer frente a futuros brotes de enfermedades infecciosas.

Dado que el propósito de este estudio era validar la función de NEC-SD-LAMP, solo se validó 1 conjunto de cebadores. Si se realiza una validación adicional de la secuencia del cebador óptima, se puede mejorar la sensibilidad de NEC-SD-LAMP. Por otro lado, los resultados de realizar SalivaDirect y LAMP en la misma muestra utilizando un ciclador térmico convencional detectaron más de 0,5 copias por µL. Además, dado que se ha informado que la PCR, el estándar de oro de los métodos de detección de virus, tiene la misma sensibilidad de detección que la LAMP cuando se utiliza para detectar ADN y ARN viral16,22, se considera posible que la PCR pueda detectar más de 0,5 copias por µL. Por lo anterior, la sensibilidad de detección de NEC-SD-LAMP es menor que la de los métodos convencionales. Esto se debe a que NEC-SD-LAMP no tiene un control de temperatura preciso en comparación con los termocicladores. El ácido palmítico calentado inmediatamente después de la reacción de SalivaDirect puede hacer que la temperatura de la solución supere los 65 °C. En tales casos, la temperatura excede la temperatura de reacción óptima para la LAMP, lo que dificulta realizar una reacción precisa. Para reacciones más óptimas, es necesario aclarar cuándo se alcanza la temperatura óptima para cada reacción aplicando un sello sensible a la temperatura al dispositivo, por ejemplo16.

Los resultados de NEC-SD-LAMP mostraron que la detección de virus era mucho más sensible cuando el análisis de la imagen J se realizaba bajo irradiación de luz de excitación. Esto indica que NEC-SD-LAMP puede mejorar la sensibilidad mediante el uso de un sistema de análisis adicional. Actualmente estamos desarrollando el microdispositivo NEC-SD-LAMP, que combina el sistema NEC-SD-LAMP con nuestro microdispositivo LAMP desarrollado previamente23. Al desarrollar el microdispositivo NEC-SD-LAMP con un sistema de conexión directa a teléfonos inteligentes y una aplicación para observar la intensidad de fluorescencia de las muestras, que se desarrollaron cuando se creó el microdispositivo LAMP, será posible una mayor reducción de costos, portabilidad y mayor sensibilidad.

NEC-SD-LAMP es un sistema que puede realizar la amplificación del ácido nucleico diana de la saliva sin electricidad, destinado a detectar virus en una etapa temprana en cualquier entorno de campo. Un método para realizar LAMP en un procedimiento sencillo y sin control eléctrico es el uso de una reacción quimioexotérmica con un calentador de bolsillo14,15,16,17,18,19. Se trata de dispositivos POCT de bajo coste y fáciles de utilizar que permiten realizar el método LAMP colocando la muestra en el calentador. Sin embargo, muchos de ellos tienen una baja sensibilidad de detección. Una razón de esto es que las reacciones quimioexotérmicas son inestables en términos de temperatura. Muchos artículos no describen ni proporcionan la validación de los cambios de temperatura por unidad de tiempo. Sin embargo, dado que en algunos casos es posible detectar concentraciones virales muy bajas16, es posible realizar pruebas tempranas si se pueden establecer las condiciones óptimas, como la proporción de componentes en el calentador y la temperatura ambiente circundante. Sin embargo, la reacción en el calentador de bolsillo solo se ha verificado a temperatura ambiente y también se ha demostrado que no se puede llevar a cabo una reacción precisa en un ambiente de baja temperatura15. Aunque se pueden ver mejoras cuando las reacciones se realizan en contenedores aislados, no hay ejemplos de métodos LAMP exitosos a temperaturas ambientales inferiores a 4 °C. NEC-SD-LAMP detectó ácidos nucleicos en una amplia gama de entornos circundantes, de -20 a 50 °C (Sup. Figs. 2 y 3). Se espera que la capacidad de realizar la amplificación de ácidos nucleicos en este rango de temperaturas proporcione tecnología de amplificación de ácidos nucleicos en casi todas las regiones del mundo. Además, la capacidad de realizar la extracción de ADN viral, lo que no es posible con LAMP utilizando calentadores de bolsillo, hace que NEC-SD-LAMP sea un sistema POCT eficaz.

Este estudio demostró la posibilidad de detección viral específica en la etapa temprana de la infección sin utilizar electricidad. Como el método SalivaDirect se desarrolló originalmente para la detección del SARS-CoV-2, NEC-SD-LAMP debe validarse utilizando virus de ARN. La degradación del ARN ocurre cuando el ARN se calienta a altas temperaturas durante mucho tiempo; en tales casos, no se puede realizar una detección precisa. Por lo tanto, sólo realizamos experimentos de validación con virus de ADN, no con virus de ARN. Para detectar con precisión virus de ARN utilizando NEC-SD-LAMP, se debe investigar con mayor precisión la cantidad de agente exotérmico y agua utilizados en la reacción exotérmica para optimizar la temperatura y el tiempo de calentamiento. Todos los experimentos de este estudio se realizaron con reactivos RT-LAMP y se puede utilizar el mismo protocolo para virus de ARN y virus de ADN. Una vez que se han estudiado las condiciones óptimas para la detección de ARN, se puede utilizar NEC-SD-LAMP para virus de ARN.

Para evaluar con precisión la especificidad y sensibilidad de NEC-SD-LAMP, es necesario realizar una gran cantidad de concentraciones límite de detección para una gran cantidad de especies de virus, o realizar experimentos de validación utilizando saliva mezclada con varias especies de virus que son diferente del virus de ADN objetivo. Además, la especificidad y sensibilidad a los virus reales no están claras porque no se han realizado pruebas de evaluación utilizando muestras de saliva de pacientes reales. Dado que el propósito de este estudio era demostrar la capacidad de detección de genes de NEC-SD-LAMP, no hemos podido verificar estas pruebas. En el futuro, planeamos realizar investigaciones sobre estos puntos en colaboración con hospitales universitarios u otras instalaciones hospitalarias, y realizar experimentos de verificación utilizando muestras de pacientes reales.

El sistema propuesto puede realizar LAMP aprovechando el hecho de que el punto de fusión del ácido palmítico es igual a la temperatura óptima para LAMP. El ácido palmítico es el ácido graso saturado más rico del cuerpo humano24. Por lo tanto, es altamente biocompatible y apropiado para POCT, y se utilizó en este dispositivo. Otros métodos isotérmicos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen el proceso de amplificación inteligente (SmartAmp), la amplificación por recombinasa polimerasa (RPA) y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA)25,26,27,28. Estos métodos se pueden realizar en este sistema usando sustancias con puntos de fusión similares a la temperatura óptima para cada reacción o usando parafina ajustada a un punto de fusión apropiado. Por tanto, este sistema podría aplicarse a varios tipos de reacciones. Sin embargo, debido a que se genera vapor de agua durante reacciones exotérmicas, si se usa una sustancia soluble en agua para la reacción de amplificación isotérmica, es posible que la reacción no se desarrolle con precisión; por tanto, es preferible utilizar sustancias liposolubles.

En el presente estudio, desarrollamos un método novedoso llamado NEC-SD-LAMP para detectar enfermedades infecciosas amplificando el ADN viral de la saliva sin utilizar un sistema de control eléctrico. En este método, toda la reacción se puede llevar a cabo agregando agua Milli-Q al dispositivo, lo que se puede realizar en ambientes no electrificados, incluida la observación de los resultados. Además, es un dispositivo pequeño que permite la reutilización de sus componentes, excepto el agente exotérmico, y puede fabricarse por menos de 20 dólares, lo que permite realizar POCT a bajo costo. Debido a que la reacción se realiza en un recipiente aislado, se puede realizar en países en desarrollo, incluidas regiones frías o tropicales, cuando se utilizan reactivos liofilizados. Este dispositivo permitirá proporcionar tecnología de prueba no sólo a los países en desarrollo sino también a las zonas de desastre donde, por ejemplo, se producen cortes de energía a gran escala. Si este dispositivo se puede utilizar para detectar ARN y ADN, NEC-SD-LAMP es un método innovador que permitirá realizar pruebas sencillas de infecciones virales en cualquier lugar del mundo.

El contenedor de PS se fabricó combinando tableros de poliestireno de 2,0 cm de espesor. Se creó un orificio de 1,0 cm de diámetro en la tapa para dirigir el vapor de agua y el hidrógeno generados fuera del recipiente. Se colocó una pieza de caucho de cloropreno de 2,0 mm de espesor entre la parte superior del recipiente y la tapa, proporcionando un sello entre la tapa y el recipiente. Se colocaron dos bandas alrededor del contenedor de PS para fijar la tapa al contenedor.

El soporte y el marco se fabricaron utilizando una impresora 3D Mojo (Stratasys, Rehovot, Israel) con una resina ABS (Mojo P430 QuickPack Print Engine, Stratasys).

El recipiente de PP estaba fabricado con una película de PP de 200 µm de espesor. El soporte y 80 g de ácido palmítico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) se colocaron dentro del recipiente, y se colocó un asa hecha de película de PP encima del recipiente de PP para facilitar la operación. El ácido palmítico (C16H32O2) es un tipo de ácido graso saturado con un punto de fusión de 62,9 °C.

Un agente exotérmico disponible comercialmente (Morians Heat Pack tamaño L; Morian Heat Pack Co. Ltd., Irima City, Japón; http://www.morians.co.jp/morians/structure.html) y un contenedor VI (SR250; ASVEL, Yamatokoriyama-shi, Japón) también se utilizaron como componentes para el dispositivo. Los componentes principales del agente exotérmico consistían en óxido de calcio y aluminio, y en este experimento se utilizaron 45 g.

Las mediciones de temperatura durante la reacción exotérmica y la reacción LAMP con ácido palmítico se realizaron utilizando un sistema de control de temperatura desarrollado previamente29. Cada temperatura en el sistema se determinó midiendo la resistencia de un termistor (104 JT; SEMITEC, Tokio, Japón) a 50 Hz y realizando cálculos en una computadora portátil. La resistencia del termistor se ingresó a una computadora portátil usando una tarjeta de PC de E/S analógica (ADA16-8/2(CB)L; CONTEC Co., Ltd., Osaka, Japón), y el programa de cálculo de temperatura se creó usando LabVIEW. ver8.2 (NI, Austin, TX, EE. UU.). Durante la reacción exotérmica, se colocó un termistor en el costado del contenedor de PS. Durante la reacción LAMP, el termistor se colocó en el costado del recipiente de PP después del almacenamiento en el recipiente VI para colocar el termistor en contacto con el ácido palmítico derretido. Se calcularon los promedios y las desviaciones estándar de las temperaturas medidas de 3 a 13 a 3 a 63 minutos después de comenzar las mediciones durante las reacciones exotérmicas y LAMP.

Se realizaron los siguientes experimentos para verificar la funcionalidad del sistema NEC-SD-LAMP. Todas las muestras de saliva fueron preparadas por el primer autor tomando su saliva y mezclándola con el ADN del adenovirus. Todo el ADN viral utilizado en este experimento se adquirió de Vircell SL. Este producto es ADN liofilizado, aislado y extraído de adenovirus. Se mezclaron 50 µL de saliva con AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL (MBC001; Vircell SL, Granada, España) hasta una concentración final de 100 copias por µL y se agregaron a un tubo de PCR. La reacción SalivaDirect se realizó mezclando MagMAX™ Viral/Pathogen Proteinase K (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con una muestra de saliva hasta una concentración final de 50 µg por µL y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, se agregaron 30 µl de aceite mineral (M-5904; Sigma‒Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) para evitar la evaporación de la muestra y se colocó el tubo de PCR en un soporte. Dentro del contenedor de PS se colocaron un agente exotérmico, un recipiente VI sin tapa, un recipiente de PP y un soporte con un tubo de PCR. Se agregaron 150 ml de agua Milli-Q para reaccionar con el agente exotérmico y calentar el interior del recipiente de PS a aproximadamente 95 °C durante 5 minutos para inactivar la proteinasa K. Se confirmó que todo el ácido palmítico en el recipiente de PP se derritió. El contenedor de PP se colocó en un contenedor VI.

Los reactivos LAMP se prepararon mezclando una mezcla de reacción 2x, una mezcla de enzimas, agua destilada, reactivo de detección de fluorescencia (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón) y seis cebadores (FI, BI, F3, B3, Loop F, y Loop B; 001–00890; LAMP Primer Design and Synthesis Service; Nippon Gene, Tokio, Japón), según el protocolo del kit RT-LAMP (Eiken Chemical Co., Ltd.). La Tabla 1 muestra las secuencias de cebadores utilizadas para detectar el ADN de adenovirus. Estos cebadores fueron diseñados, las secuencias y sintetizados por el LAMP Primer Design and Synthesis Service (Nippon Gene, Tokio, Japón). En este estudio, se validó 1 conjunto de secuencias de cebadores para cada especie de virus. La concentración final de cada cebador se ajustó a 2 µM (cebadores PI y BI), 0,25 µM (cebadores F3 y B3) o 1 µM (cebadores Loop F y Loop B). Se agregaron 20 µl del reactivo LAMP preparado y 5 µl de la muestra postSalivaDirect a un tubo de PCR (concentración final de ADN de adenovirus: 20 copias por µl). Después de agregar 20 µL de aceite mineral para evitar la evaporación, el tubo de PCR se colocó sobre un soporte en un recipiente de PP. Luego se realizó LAMP cerrando la tapa del recipiente VI y colocándolo en una mesa de laboratorio durante 1 h. Después de la reacción, se retiró el tubo de PCR del soporte, se observó el color de la solución bajo luz natural o de excitación usando un transiluminador SmartBlue (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) y cada observación se capturó usando una cámara (SO -03j; Sony Corporation, Tokio, Japón).

Para comparación, se realizaron las siguientes reacciones.

Como control negativo (NC), se utilizó una muestra de saliva sin AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL y se realizó NEC-SD-LAMP utilizando la misma reacción descrita anteriormente.

Como control positivo (PC), se preparó una muestra de saliva que contenía la misma concentración de AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL y se calentó a 95 °C durante 5 min para detener la reacción SalivaDirect y a 63 °C durante 1 h para la reacción LAMP utilizando un Ciclador térmico T100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).

Para verificar el efecto de la inactivación de la proteinasa K, preparamos una muestra que no fue calentada por un agente exotérmico después de la reacción de SalivaDirect. En este estudio se utilizó LAMP con ácido palmítico. La cantidad de muestra y concentración de reactivos utilizados en cada proceso fueron las mismas que las descritas anteriormente.

Para verificar la funcionalidad del dispositivo NEC-SD-LAMP en regiones tropicales, se instaló en una incubadora (EO-450 V; AS ONE Corporation, Osaka, Japón) calentada a 50 °C y se realizó NEC-SD-LAMP. . La cantidad de muestra y concentración de reactivos utilizados en cada proceso fueron las mismas que las descritas anteriormente.

Para verificar la funcionalidad del dispositivo NEC-SD-LAMP en regiones frías, se instaló en un congelador (SR-D40C; SANYO, Osaka, Japón) enfriado a -20 °C y se realizó NEC-SD-LAMP. La cantidad de muestra y concentración de reactivos utilizados en cada proceso fueron las mismas que las descritas anteriormente. Considerando el efecto del aumento de temperatura en el congelador debido a la reacción exotérmica, durante la fase de reacción LAMP utilizada por el ácido palmítico, la reacción se realizó en un recipiente VI instalado en otro congelador enfriado a -20 °C.

Para verificar el límite de detección de NEC-SD-LAMP, se realizaron los siguientes experimentos.

Todas las muestras de saliva fueron preparadas por el primer autor tomando su saliva y mezclándola con el ADN del adenovirus. Todo el ADN viral utilizado en este experimento se adquirió de Vircell SL. Se mezclaron 50 µL de saliva con AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL hasta una concentración final de 1000 copias por µL y se agregaron a un tubo de PCR. Se utilizó el mismo procedimiento detallado en la sección "Experimento de verificación NEC-SD-LAMP" para realizar las reacciones exotérmicas y SalivaDirect.

El método LAMP con calentamiento con ácido palmítico se realizó utilizando el mismo procedimiento que en el "experimento de verificación NEC-SD-LAMP", después del cual se observó el color de la solución bajo luz natural o de excitación en un transiluminador SmartBlue. Para LAMP, la muestra de reacción postSalivaDirect se diluyó usando agua Milli-Q hasta concentraciones finales de 1, 2, 10, 20, 100 y 200 copias por µL de ADN de adenovirus, y cada observación se capturó usando una cámara. Estas imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud).

Como experimento de comparación, se realizaron las siguientes reacciones.

Como control negativo (NC), se utilizó una muestra de saliva sin AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL y se realizó NEC-SD-LAMP utilizando la misma reacción descrita anteriormente.

Para confirmar la concentración límite de detección mediante el método convencional, se preparó una muestra de saliva que contenía la misma concentración de AMPLIRUN ADENOVIRUS DNA CONTROL y se calentó a 95 °C durante 5 min para detener la reacción de SalivaDirect y a 63 °C durante 1 h para la lámpara LAMP. reacción utilizando un termociclador T100.

Como experimento NEC-SD-LAMP de gran volumen, NEC-SD-LAMP se realizó en un tubo de 1,5 ml. La concentración del reactivo fue la misma que la descrita anteriormente y la reacción se realizó con un aumento de cuatro veces en el volumen total de la solución. La concentración final de ADN de adenovirus se ajustó a 0 (NC), 0,5 y 1 copia por µL.

Se realizaron los siguientes experimentos para verificar la especificidad de NEC-SD-LAMP. Todas las muestras de saliva fueron preparadas por el primer autor tomando su saliva y mezclándola con ADN de adenovirus tipo 41 o citomegalovirus. Todo el ADN viral utilizado en este experimento se adquirió de Vircell SL. Este producto es ADN liofilizado, aislado y extraído de adenovirus tipo 41 o citomegalovirus. Se mezclaron 50 µL de saliva con AMPLIRUN ADENOVIRUS 41 DNA CONTROL (MBC114, Vircell) o AMPLIRUN CYTOMEGALOVIRUS DNA CONTROL (MBC016, Vircell) hasta una concentración final de 100 copias por µL y se agregaron a un tubo de PCR. Se utilizó el mismo procedimiento detallado en la sección "Experimento de verificación NEC-SD-LAMP" para realizar las reacciones exotérmicas y SalivaDirect. El método LAMP con calentamiento con ácido palmítico se realizó utilizando el mismo procedimiento que en el "experimento de verificación NEC-SD-LAMP", después del cual se observó el color de la solución bajo luz natural o de excitación en un transiluminador SmartBlue. La Tabla 1 muestra las secuencias de cebadores utilizadas en este experimento. Estos cebadores fueron diseñados, las secuencias y sintetizados por el LAMP Primer Design and Synthesis Service (Nippon Gene, Tokio, Japón).

Como experimento de comparación, se realizaron las siguientes reacciones.

Como control negativo 1 (NC1), se utilizó una muestra de saliva sin ADN viral y se realizó NEC-SD-LAMP utilizando la misma reacción descrita anteriormente.

Se utilizó una muestra de saliva que contenía cada ADN viral como control negativo 2 (NC2) y se realizó NEC-SD-LAMP utilizando un cebador de detección de ADN adenoviral.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

Yager, P. y col. Tecnologías de diagnóstico de microfluidos para la salud pública global. Naturaleza 442, 412–418 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Urdea, M. et al. Requisitos para diagnósticos de alto impacto en el mundo en desarrollo. Nature 444 (Suplemento 1), 73–79 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Yager, P., Domingo, GJ & Gerdes, J. Diagnóstico en el punto de atención para la salud global. Año. Rev. Biomed. Ing. 10, 107-144 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Flambard, J., Amirat, Y., Feld, G., Benbouzid, M. & Ruiz, N. Descripción general de la energía actual del río y el estuario. J. Mar. Ciencias. Ing. 7, 365 (2019).

Artículo de Google Scholar

Lee, WG, Kim, YG, Chung, BG, Demirci, U. & Khademhosseini, A. Nano/Microfluídica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en países en desarrollo. Adv. Entrega de drogas. Rev. 62, 449–457 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, Z. y col. Detección rápida y sensible de IgG anti-SARS-CoV-2 mediante inmunoensayo de flujo lateral basado en nanopartículas dopadas con lantánidos. Anal. Química. 92, 7226–7231 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roda, A. et al. Inmunosensores ópticos/quimioluminiscencia de flujo lateral dual para la detección rápida de IgA en saliva y suero en pacientes con enfermedad COVID-19. Biosens. Bioelectrón. 172, 112765 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Notomi, T. y col. Amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle. Ácidos nucleicos res. 28, E63 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T. y Notomi, T. Reacción de amplificación isotérmica mediada por bucle utilizando una plantilla no desnaturalizada. Clínico. Química. 47, 1742-1743 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nagamine, K., Hase, T. & Notomi, TJMCP Reacción acelerada mediante amplificación isotérmica mediada por bucle utilizando cebadores de bucle. Mol. Celúla. Sondas 16, 223–229 (2022).

Artículo de Google Scholar

Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. y Notomi, T. Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) de secuencias de genes y detección visual simple de productos. Nat. Protocolo. 3, 877–882 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mackay, IM, Arden, KE y Nitsche, A. PCR en tiempo real en virología. Ácidos nucleicos res. 30, 1292-1305 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sethuraman, N., Jeremiah, SS y Ryo, A. Interpretación de pruebas de diagnóstico para SARS-CoV-2. JAMA 323, 2249–2251 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y. et al. Ensayos multiplexados de ácidos nucleicos en el lugar de atención mediante amplificación isotérmica mediada por bucle basada en microcapilares. Anal. Química. 86, 7057–7062 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ben, H. y col. LAMP que utiliza un calentador de bolsillo desechable para la detección de ántrax, un método altamente móvil y confiable para combatir el bioterrorismo. Japón. J. Infectar. Dis. 63, 36–40 (2010).

Artículo de Google Scholar

Yun, HB y cols. Diagnóstico molecular portátil simple, rápido y sensible del virus SFTS mediante amplificación isotérmica mediada por bucle transcripcional inversa (RT-LAMP). J. Microbiol. Biotecnología. 28, 1928-1936 (2018).

Artículo de Google Scholar

Ben, H. y col. Sistema de detección móvil y preciso de la infección por el virus de la influenza pandémica A (H1N1) de 2009 con amplificación isotérmica mediada por bucle de transcriptasa inversa y calentador de bolsillo. J. Med. Virol. 83, 568–573 (2011).

Artículo de Google Scholar

Antonio, A. y col. Detección de Mycobacterium ulcerans mediante el método de amplificación isotérmica mediada por bucle. PLoS Negl. tropo. Dis. 6, e1590 (2012).

Artículo de Google Scholar

Kim, D., Kim, SJ, Kim, YK, Kwon, KT y Kim, S. Evaluación clínica de un innovador sistema de detección de amplificación isotérmica para el diagnóstico de COVID-19. Anal. Métodos 14, 2578–2585 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vogels, C. y col. SalivaDirect: Diagnóstico del SARS-CoV-2 sin extracción de ARN. protocolos.io (2020).

Panno, S. y col. Amplificación isotérmica mediada por bucle: principios y aplicaciones en virología vegetal. Plantas (Basilea) 9, 461 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kenta, M. y col. Evaluación de la cuantificación del ARN del SARS-CoV-2 mediante RT-LAMP en comparación con RT-qPCR. J. Infectar. Chemadre. 27, 1068–1071 (2021).

Artículo de Google Scholar

Kimura, Y., Ikeuchi, M., Inoue, Y. & Ikuta, K. Chip de prueba en el punto de atención para la detección de infecciones por virus múltiples utilizando LAMP. En Conf Proc IEEE 32.a Conferencia internacional sobre sistemas microelectromecánicos 83–86 (2019).

Eva, G. y col. Aceite de palma en el borde. Nutrientes 11, 2008. https://doi.org/10.3390/nu11092008 (2019).

Artículo de Google Scholar

Piepenburg, O., Williams, CH, Stemple, DL y Armes, NA Detección de ADN mediante proteínas de recombinación. Más Biol. 4, e204 (2006).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HE y cols. Biosensor electroquímico sensible combinado con amplificación isotérmica para pruebas de COVID-19 en el lugar de atención. Biosens. Bioelectrón. 182, 113168 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitani, Y. et al. Diagnóstico rápido de SNP mediante amplificación isotérmica asimétrica y una nueva tecnología de supresión de desajustes. Nat. Métodos 4, 257–262 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sharma, A. y col. Diagnóstico de COVID-19: Técnicas actuales y futuras. En t. J. Biol. Macromol. 193, 1835–1844 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimura, Y., Ikeuchi, M., Inoue, Y. & Ikuta, K. Microdispositivos 3D que realizan extracción de muestras y qRT-PCR multiplex para la detección temprana del cáncer con confirmación de ARN específicos. Ciencia. Rep. 8, 17480 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por JST, ACT X (número de subvención JPMJAX21K4), Japón y el Centro de Investigación de Ingeniería Biomédica. Este artículo fue editado por el Servicio de Edición de Nature Research.

Departamento de Ingeniería Biomédica de Precisión, Instituto de Biomateriales y Bioingeniería, Universidad Médica y Dental de Tokio, 2-3-10 Kandasurugadai, Chiyoda-ku, Tokio, Japón

Yusuke Kimura y Masashi Ikeuchi

Departamento de Investigación de Materiales Funcionales Avanzados, Instituto de Investigación de Radiación Avanzada de Takasaki, Institutos Nacionales de Ciencia y Tecnología Cuánticas (QST), 1233 Watanuki-machi, Takasaki, Gunma, Japón

Yusuke Kimura

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YK y MI concibieron el estudio. YK realizó los experimentos y analizó los datos. MI contribuyó a la preparación del manuscrito y YK escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Masashi Ikeuchi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Película complementaria 1.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Kimura, Y., Ikeuchi, M. Desarrollo de SalivaDirect LAMP (NEC-SD-LAMP) no controlada eléctricamente, un nuevo método de prueba de enfermedades infecciosas no eléctrico. Representante científico 13, 11791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38800-8

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Recibido: 09 de mayo de 2023

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38800-8

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