Virus

Blog

HogarHogar / Blog / Virus

Aug 19, 2023

Virus

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4101 (2023) Cite este artículo 1081 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La expresión y purificación de miosina es importante para obtener conocimientos mecanicistas sobre

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4101 (2023) Citar este artículo

1081 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La expresión y purificación de miosina es importante para obtener conocimientos mecanicistas sobre la función normal y los cambios inducidos por mutaciones. Esto último es particularmente importante para la miosina II del músculo estriado, donde las mutaciones causan varias enfermedades debilitantes. Sin embargo, la expresión de la cadena pesada de esta miosina es un desafío y el protocolo estándar, que utiliza células C2C12, se basa en una infección viral. Esto requiere mucho tiempo y trabajo y está asociado con demandas de infraestructura y peligros biológicos, lo que limita su uso generalizado y obstaculiza la generación rápida de una amplia gama de mutaciones. Aquí desarrollamos un método libre de virus para superar estos desafíos. Utilizamos este sistema para transfectar células C2C12 con el dominio motor de la cadena pesada de miosina cardíaca humana. Después de optimizar las condiciones de transfección, cultivo y recolección celular, caracterizamos funcionalmente la proteína expresada, copurificada con cadenas ligeras reguladoras y esenciales murinas. La velocidad de deslizamiento (1,5–1,7 µm/s; 25 °C) en el ensayo de motilidad in vitro, así como la actividad catalítica activada por actina máxima (kcat; 8–9 s−1) y la concentración de actina para la mitad de la actividad máxima (KATPasa; 70 –80 µM) fueron similares a los encontrados anteriormente usando infección basada en virus. Los resultados deberían permitir nuevos tipos de estudios, por ejemplo, la selección de una amplia gama de mutaciones para una mayor caracterización.

Las miosinas son motores moleculares que desarrollan fuerza y ​​movimiento al interactuar con los filamentos de actina en un proceso cíclico impulsado por el recambio de ATP. Este proceso es la base de una variedad de funciones importantes, como la contracción muscular, la motilidad/desarrollo de fuerza de las células no musculares, el transporte de carga intracelular y la señalización celular1. Recientemente se identificaron hasta 79 clases2 en la superfamilia de miosina. Todos ellos están construidos alrededor de una cadena pesada de miosina (MHC; ~ 90–250 kD) con un sitio de unión a actina, un sitio catalítico de ATPasa y otros elementos de importancia para la función motora, así como para la formación de filamentos y la unión de carga. Además, a cada una de las cadenas pesadas se unen cadenas ligeras, con funciones estabilizadoras, moduladoras y reguladoras. Para conocer los mecanismos básicos de la función motora de la miosina, pero también para estudios detallados de las mutaciones que causan enfermedades, es importante poder expresar y purificar todos los componentes proteicos mencionados.

El sistema más utilizado para expresar y purificar proteínas se basa en E. coli como huésped de expresión, lo que da como resultado altos rendimientos de purificación (si el producto de expresión es soluble), además de mano de obra y rentabilidad3. Sin embargo, el sistema procariótico carece de maquinaria celular completa para ayudar al plegamiento apropiado y a la modificación postraduccional de las proteínas eucarióticas. Mientras que la expresión y purificación de cadenas ligeras de miosina funcionales es posible utilizando E. coli, las cadenas pesadas de miosina (MHC) no pueden producirse en forma funcional utilizando este sistema4. Por lo tanto, se han desarrollado una variedad de sistemas de expresión y purificación eucariotas basados ​​en Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, células de insectos9,10,11,12,13,14 y células de mamíferos15,16. Aunque estos sistemas funcionan bien para la producción de una variedad de clases de MHC, han tenido un éxito limitado con las miosinas del músculo estriado de vertebrados17,18,19, probablemente debido a que no incluyeron toda la maquinaria de plegamiento de proteínas de las células musculares. Aunque varios artículos han identificado a UNC-45 como un acompañante involucrado en el plegamiento de la miosina y el ensamblaje de sarcómeros20,21,22,23,24, parece haber otros factores involucrados, como Hsp70/Hsp9025 y chaperonina26. De acuerdo con este punto de vista, Winkelmann y sus colegas presentaron evidencia de que el plegamiento apropiado de las miosinas del músculo estriado en una forma completamente funcional sólo ocurre en un ambiente diferenciado similar al músculo, es decir, miotubos musculares27,28,29. Con base en esta idea, se introdujeron mioblastos C2C12 de ratón que se diferencian en miotubos como una línea celular huésped de expresión de elección27. Los mioblastos se transfectaron con plásmidos que transportaban MHC de músculo esquelético de embrión de pollo bajo un promotor, lo que garantiza que la expresión de MHC comience solo tras la diferenciación en miotubos. El rendimiento de la purificación fue suficiente para evaluar la función de la miosina en función de la actividad de la ATPasa activada por actina. La generación de líneas celulares estables27 en esta versión inicial del sistema de purificación y expresión basado en C2C12 (“sistema basado en C2C12” de aquí) ofrece rendimientos de purificación relativamente altos con un flujo de trabajo rentable y en tiempo que elimina los ciclos de transfección. Sin embargo, el desarrollo de una línea celular estable puede requerir hasta 12 meses30 y no sería el mejor enfoque para examinar varias construcciones diferentes (por ejemplo, mutaciones puntuales) de una miosina en particular. Por el contrario, la expresión transitoria ofrece la ventaja de un tiempo de desarrollo corto y una rotación rápida30. Por lo tanto, el sistema basado en C2C12 se modificó posteriormente utilizando la expresión transitoria de adenovirus para introducir y estudiar el impacto de las mutaciones puntuales de miosina asociadas con las miocardiopatías hipertróficas31. Resnicow et al.32 optimizaron aún más el mismo sistema para permitir la producción de cantidades suficientes de MHC para el análisis cinético transitorio de isoformas de miosina cardíaca y esquelética humana recombinante33,34,35. Es de destacar que en estos estudios se lograron actividades ATPasa considerablemente mayores para la miosina β-cardíaca tanto de tipo salvaje (WT) como mutante que en un informe anterior19 en el que se expresaron y purificaron mutantes de miosina β-cardíaca humana a partir de células de insectos. Actualmente, la infección basada en adenovirus de los miotubos C2C12 permite la producción de cantidades suficientes de miosinas de músculo estriado funcionales y plegadas adecuadamente (construcciones similares a S1 y HMM) para estudios funcionales críticos, entre otros, ensayos de motilidad in vitro y cinética de soluciones bioquímicas transitorias34,36.

Mientras que el sistema basado en C2C12, que depende de la administración de genes virales, proporciona un alto rendimiento de proteínas funcionales, requiere mucho tiempo y trabajo, además de ser costoso, en comparación con otros sistemas basados ​​en células de mamíferos. Esto se debe tanto al método de administración de genes basado en adenovirus como al modo adherente de crecimiento de las células C2C12. En cuanto al uso de adenovirus, esto requiere tiempo y trabajo, por ejemplo, debido al requisito de una serie de pasos de enriquecimiento y purificación utilizando una línea celular humana (por ejemplo, HEK293) para obtener un título de virus suficiente37,38. Otras limitaciones relacionadas con la entrega de genes basados ​​en virus incluyen la clonación gradual de plásmidos muy grandes que deben incluir secuencias genéticas virales39. Esto limita el tamaño del inserto y la posibilidad de mutagénesis del virus o de la línea celular40. Además, la manipulación de virus supone un peligro potencial para el personal y requiere un mayor nivel de seguridad de la infraestructura del laboratorio con formación adicional del personal. Estos requisitos hacen que el sistema basado en C2C12 sea menos accesible para el uso rutinario8. Lo que falta a este respecto es un método de transfección eficaz y libre de virus.

Sin embargo, se sabe que las células musculares, como los mioblastos C2C12, especialmente en su forma diferenciada (p. ej., miotubos y cardiomiocitos), son difíciles de transfectar41. Los métodos químicos no virales comúnmente utilizados para la administración de genes in vitro (p. ej., polietilenimina, fosfato cálcico) se asociaron frecuentemente con baja eficiencia, ineficacia en términos de costos y baja supervivencia celular41,42,43,44,45,46,47. Por tanto, las configuraciones experimentales se limitaron a pequeñas escalas de cultivos de mioblastos de baja confluencia. Los métodos físicos como la electrotransferencia de genes mediante electroporación pueden ser muy eficientes. Sin embargo, nuevamente están limitados por los requisitos de equipos especiales y el modo de acción a pequeña escala48,49,50. Para la purificación de proteínas, es crucial que el método de administración de genes no solo sea eficiente y competitivo en cuanto a costos, sino que también sea fácilmente aplicable a volúmenes celulares más grandes51, lo que explica por qué la expresión génica transitoria en células C2C12 ha estado dominada por la administración de genes virales52.

Sin embargo, más recientemente se ha ampliado la disponibilidad de agentes de transfección química no virales y se ha reducido el costo. Algunos proveedores incluso ofrecen protocolos (notas de aplicación) para transfectar células C2C12 con la alta eficiencia prometida. Aquí hemos examinado un kit de transfección de ADN asequible y disponible comercialmente, Polyplus JetPrime. Hasta donde sabemos, el reactivo de transfección JetPrime no se ha utilizado previamente en la producción de miosina del músculo estriado utilizando células C2C12. Su uso nos permitió desarrollar un protocolo detallado para la expresión transitoria y la purificación de cadenas pesadas de miosina cardíaca humana (β-MHC) en células C2C12. Demostramos la eficacia del enfoque mediante la expresión y purificación del β-MHC humano seguido de la validación en ensayos funcionales. En general, la comparación de nuestros resultados con datos anteriores, basados ​​en la administración de genes basados ​​en virus53,54,55, muestra diferencias funcionales mínimas, siempre que la longitud de la construcción de miosina y la composición de la cadena ligera sean similares. Prevemos que nuestros resultados deberían hacer que el sistema de purificación y expresión basado en C2C12 sea más atractivo y accesible para la producción de MHC del músculo estriado. No menos importante, la generación apreciablemente más rápida de mutantes y la purificación de proteínas más segura que en los sistemas basados ​​en virus serían ventajosas cuando el propósito es estudiar una amplia variedad de mutaciones, por ejemplo, en (cardio)miopatías56,57,58.

La producción de proteínas recombinantes mediante la técnica de expresión génica transitoria depende en gran medida de la eficacia de la transfección. En general, los parámetros de transfección deben optimizarse para cada combinación de reactivo de transfección y plásmido, que porta el gen de interés (GOI), para garantizar rendimientos eficientes de purificación de proteínas. Aquí utilizamos el reactivo de transfección JetPrime que, hasta donde sabemos, no se ha utilizado previamente para la producción de miosina del músculo estriado en células C2C12. Aunque este reactivo de transfección va acompañado de un protocolo (nota de aplicación) para células C2C12, hemos vuelto a probar los parámetros de transfección utilizando nuestro plásmido de trabajo, que lleva la construcción del dominio motor de miosina cardíaca β (S1L; Fig. 1A). Esta construcción, codón optimizado para la expresión en líneas celulares huésped de origen de ratón, es bastante similar a las utilizadas anteriormente para la transfección basada en virus de un subfragmento largo de miosina 1 (aa 1–843; S1L) en células C2C12 (Tabla S1). Sin embargo, nuestro plásmido está fusionado con una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) con una etiqueta FLAG en su terminal C, en lugar de una etiqueta Avi como en trabajos anteriores con S1L. La eGFP es una etiqueta útil en varios aspectos, incluido el seguimiento del progreso de la expresión, la inmovilización de la superficie en el ensayo de motilidad in vitro y la localización del dominio motor de miosina en estudios de molécula única (consulte los resultados preliminares en la Fig. S1). El modo de transfección se basa en complejos ADN:JetPrime formados correctamente. La cantidad de ambos ingredientes, y particularmente su proporción, son por tanto parámetros importantes, que pueden depender del plásmido utilizado (por ejemplo, debido a la diferencia en el tamaño del plásmido, la estructura y la conformación del plásmido). Por lo tanto, inicialmente, probamos la eficiencia de la transfección en diferentes proporciones ADN:JetPrime. Como se ve en la Fig. 1B, la eficiencia de la transfección se mantuvo óptima para una amplia gama de proporciones, y la eficiencia comenzó a disminuir solo en las proporciones más altas probadas. Basándonos en los resultados, hemos mantenido la proporción 1:2 para futuros experimentos, como se recomienda en la nota de aplicación de la empresa. El siguiente parámetro que probamos fue la cantidad de ADN por número de células sembradas. La nota de aplicación de la empresa sugiere 0,75 µg por 4 × 104 células, sembradas en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Para un pocillo de una placa de 12 pocillos con un área de pocillo aproximadamente dos veces mayor (como se utiliza en nuestro estudio), esto corresponde a 1,5 µg de ADN por 8 × 104 células sembradas por pocillo. Probamos la cantidad de ADN recomendada y algunos valores más altos, que ocasionalmente pueden mejorar la transfección baja. Los resultados de la Fig. 1C demuestran que cantidades mayores de ADN no mejoraron la eficiencia de la transfección; más bien condujeron a su declive. Por lo tanto, mantuvimos la cantidad de ADN recomendada por número de células sembradas para experimentos posteriores.

Optimización de la transfección y expresión. (A) Caricatura64 de la construcción de expresión con residuos de aminoácidos indicados de partes específicas. (B) Eficiencia de transfección en diferentes proporciones ADN:JetPrime. Tenga en cuenta el rango eficiente relativamente amplio donde se eligió 1:2 para experimentos posteriores. (C) Eficiencia de transfección con diferentes cantidades de plásmido (ADN) por número de células sembradas (aquí 8 × 104 células). Se eligió la cantidad de 1,5 µg para experimentos posteriores. (D) Eficiencia de transfección para aumentar el número de siembra celular y dos períodos de crecimiento después de la siembra (24 y 48 h) antes de la transfección celular. Tenga en cuenta que el aumento del número de células no mejoró la transfección celular; La siembra del menor número de células con crecimiento durante 2 días proporcionó la mejor eficiencia de transfección. (E) Eficiencia de la transfección evaluada en cada uno de los 8 días posteriores a la transfección. Abajo derecha: Eficiencia de transfección estimada como fracción del área con fluorescencia de GFP. Arriba a la derecha: Western blot utilizando anticuerpos anti-FLAG utilizados para cuantificar la cantidad de construcción expresada. La transferencia original se presenta en la figura complementaria S2. Todos los gráficos de barras con datos individuales representan la media ± DE de 3 a 6 imágenes (campo de visión) por plato de cultivo celular (pozo). Las barras de escala representan 100 µm.

Como se describe en la Introducción, el plegamiento adecuado de las miosinas del músculo estriado sólo ocurre en miotubos diferenciados. Por tanto, es importante que los mioblastos C2C12 entren en el proceso de diferenciación lo antes posible después de la transfección. Esto se puede lograr de manera más eficiente cuando los mioblastos están completamente confluentes. En la nota de aplicación del fabricante, la densidad celular de siembra óptima resulta en una confluencia celular del 60% al 70% en el momento de la transfección. La confluencia más baja suele ser beneficiosa para la eficiencia de la transfección. Sin embargo, en nuestro caso retrasa la diferenciación de miotubos más necesaria. Por lo tanto, examinamos la eficiencia de la transfección en varias densidades de siembra de células diferentes y utilizando dos puntos de tiempo diferentes para la transfección después de la siembra de células (es decir, células que crecen durante 24 o 48 h antes de la transfección). El objetivo era alcanzar cerca del 100% de confluencia celular en el momento de la transfección. Nuestro principal hallazgo fue que el uso del número de siembra de células recomendado de 8 × 104 por pocillo, pero la transfección 48 h después de la siembra de células en lugar de las 24 h recomendadas, dio como resultado la mayor eficiencia de transfección (Fig. 1D). La confluencia celular en ese momento también estaba cerca del 100%, lo que aseguró una rápida progresión hacia la diferenciación y la formación de miotubos. Con base en estos experimentos, el número de siembra de células recomendado se utilizó en nuestro protocolo final empleando placas de cultivo de 60 mm de diámetro donde las células se cultivaron durante 36 h antes de la transfección. Aquí, se utilizaron 36 h en lugar de 48 h (Fig. 1D) según experimentos piloto con placas de cultivo celular de 60 mm.

Por último, determinamos el momento óptimo de recolección de células después de la transfección para lograr la máxima expresión de proteínas. Como puede verse en la Fig. 1E, la expresión aumentó con el tiempo en términos del área celular transfectada total, así como la cantidad de proteína expresada, evaluada mediante transferencia Western, mostrando una tendencia hacia la saturación en los días 7-8.

El análisis anterior es la base para el protocolo optimizado y su adaptación para la transfección a mayor escala utilizando varias placas de cultivo celular de 60 mm para expresar la construcción S1L de miosina β-cardíaca (S1L-eGFP-FLAG, Fig. 1A). Este protocolo se describe en detalle en los Procedimientos experimentales. Después de recolectar las células el día 7 después de la transfección, las células se lisaron y la construcción S1L se capturó del lisado celular (Fig. 2A arriba) usando una resina de purificación que consiste en perlas de escala micrométrica decoradas con anticuerpos anti-FLAG. La proteína unida se eluyó mediante competencia con un exceso de péptido FLAG libre (Fig. 2A abajo). Un gel de proteína SDS-PAGE representativo (Fig. 2B) muestra una preparación de miosina purificada donde la construcción S1L se copurifica con cadenas ligeras endógenas de ratón. Algunos otros contaminantes proteicos menores son consecuencia de las uniones inespecíficas del lisado celular a los anticuerpos anti-FLAG en las perlas de purificación, como lo sugieren los resultados simulados del gel de purificación. Según lo evaluado por eGFP, se logró la absorción a 488 nm hasta 0,08 µg y en promedio 0,04 ± 0,02 µg (media ± DE, n = 5) por cm2 de células transfectadas. Por tanto, la purificación de proteínas utilizando células de diez placas de cultivo de 60 mm produjo hasta 13 µg de proteína a una concentración de 1,4 µM.

Purificación por afinidad utilizando resina de anticuerpo anti-FLAG (perlas). (A) Arriba: fluorescencia GFP de perlas después de capturar las proteínas expresadas mediante la etiqueta FLAG. Abajo: perlas (que se muestran en las mismas condiciones de microscopía que en la parte superior) que muestran una fluorescencia perdida después de la elución con el péptido FLAG 3X. Barras de escala: 200 µm. (B) Izquierda: análisis de elución SDS-PAGE que muestra la construcción S1L-eGFP-FLAG de cadena pesada de miosina β-cardíaca humana purificada (carril 1, MHC; 125,5 kDa) copurificada con ELC murinas (~ 23 kDa) y RLC (~ 19 kDa). Derecha: Purificación simulada utilizando células C2C12 no transfectadas que muestran que los pequeños contaminantes proteicos (carril 2) son el resultado de la unión del lisado celular inespecífico a la resina que coeluyó después de la incubación con el péptido FLAG 3X. Los geles originales se presentan en la figura complementaria S3.

Luego procedimos a caracterizar la construcción de miosina purificada midiendo la ATPasa basal en estado estacionario y activada por actina utilizando un ensayo acoplado a NADH. Los datos espectrofotométricos para la actividad ATPasa en estado estacionario de S1L-eGFP-FLAG se ilustran en las Figs. 3A y B con los parámetros cinéticos resumidos en la Tabla 1. La actina aumentó la actividad ATPasa en estado estacionario de S1L-eGFP-FLAG aproximadamente 200 veces (de kbasal ~ 0,04 a kcat ~ 8 s-1), con una KATPasa ~ 80 µM, que es la concentración de actina a la mitad de la actividad ATPasa máxima (Tabla 1). Un ensayo más sensible en términos de la fracción de cabezas activas en la muestra S1L-eGFP-FLAG purificada es el ensayo de motilidad in vitro (IVMA), en el que las proteínas motoras adheridas a la superficie observan el deslizamiento de los filamentos de actina. Los resultados de IVMA de dos experimentos independientes de expresión y purificación se presentan en las figuras 3C y D (Películas S1-S2). Las velocidades de deslizamiento de los filamentos de actina fueron en promedio 1,5 y 1,8 µm/s para las dos preparaciones (Fig. 3C, Tabla 1). Como en estudios anteriores, utilizando un fragmento motor S1 más corto (sS11-808aa)35,59,60, fue necesaria la eliminación de las cabezas inactivas mediante purificación por afinidad (“deadheading”) para lograr una buena motilidad. La fracción de filamentos móviles (FMF) alcanzó en promedio 60 y 69%, con uno y dos puntos muertos, respectivamente (Fig. 3D, Tabla 1). Desafortunadamente, no pudimos encontrar ningún dato para la fracción de filamentos móviles en trabajos anteriores utilizando S1L obtenido con transfección viral para comparación.

Ensayos funcionales de la construcción S1L β-cardíaca humana purificada copurificada con cadenas ligeras de miosina murina. (A) evolución temporal del recambio de ATP, utilizando un ensayo acoplado a NADH, con [S1L-eGFP-FLAG] y [MgATP] constantes pero con [actina F] (concentración relacionada con los monómeros) en 5 (a), 10 ( b), 15 (c), 20 (d), 30 (e), 40 (f), 60 (g), 80 (h) o 100 (i). (B) Actividad de la ATPasa en estado estacionario activada por actina en función de la [actina F]. La línea continua que pasa por los puntos de datos es el mejor ajuste de la ecuación. (1) a los datos con los parámetros de mejor ajuste presentados en la Tabla 1. Los datos de tres preparaciones de proteínas independientes se muestran en diferentes colores. (C) Las velocidades de deslizamiento de los filamentos de actina en el ensayo de motilidad in vitro a 25 °C para dos preparaciones de proteínas diferentes (Prep 1 y Prep 2). Los datos se superponen a la media ± 95 % de IC de 25 a 30 filamentos para cada preparación. (D). La fracción de filamentos móviles después de una (para la Preparación 1) o dos (para la Preparación 2) purificaciones por afinidad (“deadheadings”). Los datos se superponen a la media ± 95 % de IC de 5 campos de visión por celda de flujo para cada preparación. (E) Velocidades de deslizamiento del filamento de actina versus longitudes del filamento (los mismos datos que en C para la Preparación 1). (F) Velocidades de deslizamiento del filamento de actina versus longitudes del filamento (los mismos datos que en C para la Preparación 2). Las líneas horizontales rectas en E y F indican valores medios que sugieren una dependencia mínima de la velocidad de las longitudes de los filamentos en longitudes > 3 µm.

La densidad motora en la superficie del ensayo de motilidad in vitro depende tanto de la densidad de los anticuerpos adecuadamente orientados como de las condiciones de incubación (tiempo y concentración) de los fragmentos motores de miosina. Mientras que no medimos la densidad del motor, la velocidad casi constante, para longitudes de filamento de actina> 3 µm (Fig. 3E, F), sugiere que la densidad es suficiente para alcanzar la velocidad de deslizamiento máxima que luego estaría limitada por la densidad del motor. tasa de desprendimiento del puente constante (como en el músculo) sin efectos de la tasa de inserción61,62. Una consideración al interpretar los resultados en la Fig. 3E, F es que se sabe que la velocidad se satura para filamentos suficientemente largos también con densidades de miosina bajas, pero a un valor más bajo61. Sin embargo, estamos seguros de que la densidad motora es lo suficientemente alta en nuestro estudio como para motivar la conclusión de que la velocidad está limitada por el desprendimiento. En primer lugar, la saturación ya se produjo en longitudes de filamento de aproximadamente 3 µm en lugar de en longitudes más largas encontradas con densidades motoras bajas en el estudio de Uyeda et al.61. Además, como evidencia adicional de una densidad motora suficiente para dar una velocidad limitada al desprendimiento, las velocidades máximas observadas en nuestro estudio son similares a las encontradas en trabajos anteriores que utilizaron la producción de proteínas basadas en adenovirus (Tabla S1 y Fig. S4) y también consistentes con aquellas. encontrado en las células musculares63.

El actual sistema de expresión y purificación de última generación para miosinas del músculo estriado de vertebrados se basa en la transferencia de genes virales a células C2C12. Si bien la transferencia de genes virales garantiza una alta eficiencia en la entrega de genes y, en consecuencia, altos rendimientos de expresión y purificación de proteínas, también tiene desventajas, como se menciona en la Introducción (consulte también la Fig. S5). Esto probablemente explica su implementación limitada en todo el mundo, impidiendo el crecimiento del entorno de investigación, obstaculizando tanto las pruebas a gran escala de nuevas ideas como la confirmación amplia e independiente de resultados anteriores. De hecho, hasta donde sabemos, sólo un puñado de laboratorios en todo el mundo (por ejemplo, reflejado en 32,33,34,53,65,66,67) utilizan con éxito miosinas musculares de vertebrados recombinantes de forma regular. Nuestra hipótesis es que reemplazar la transferencia de genes virales con un enfoque más conveniente y fácil de usar, con respecto a los requisitos de infraestructura y personal, sería un primer paso hacia una usabilidad más amplia del método. Además, creemos que un primer paso para lograr esto es demostrar e informar completamente un enfoque sencillo que permita la producción de fragmentos motores de miosina II del músculo estriado purificados útiles en ensayos funcionales básicos. Nuestro método de transfección no viral descrito para células C2C12 basado en el reactivo de transfección JetPrime es un enfoque de este tipo. Primero probamos y optimizamos diferentes parámetros de transfección para la transfección de la construcción S1L-eGFP-FLAG en células C2C12 para sentar las bases del método. En este trabajo utilizamos una construcción (consulte la declaración de disponibilidad de datos a continuación) que está optimizada para codones para su expresión en el fondo del huésped del ratón. Nuestras pruebas para optimizar el protocolo incluyeron variar la proporción de ADN a JetPrime, la proporción de [ADN] a células, la confluencia celular en el momento de la transfección y, finalmente, el momento de la recolección de células. Si bien algunas de las pruebas confirmaron los valores de los parámetros de la nota de aplicación de la empresa, descubrimos que otros parámetros requerían una mayor optimización. Esto está particularmente relacionado con el hecho de que el plegamiento adecuado de la miosina muscular requiere condiciones musculares maduras que solo se garantizan en los miotubos C2C12 diferenciados y no en la etapa de mioblastos. En consecuencia, la transferencia de genes virales a menudo se realiza en la etapa de miotubo (sin embargo, ver53,66).

Los miotubos o cualquier otra célula muscular diferenciada son muy difíciles de transfectar utilizando métodos no virales. Por lo tanto, en la nota de solicitud de la empresa se indica realizar la transfección JetPrime de mioblastos con una confluencia de monocapa del 70 % para lograr altas eficiencias de transfección, como se examinó 24 h después. Para nuestro propósito, este enfoque presenta el riesgo de que la miosina expresada no se pliegue adecuadamente, debido a la falta de maquinaria de plegado adecuada en los mioblastos, lo que lleva a la acumulación y agregación de cabezas de miosina inactivas. Por lo tanto, las optimizaciones importantes del protocolo descritas aquí incluyen (i) la transfección de mioblastos con una confluencia cercana al 100% y su diferenciación comienza inmediatamente después del período de transfección (4 h) y (ii) el día de recolección óptimo cuidadosamente seleccionado después de la transfección. Ambos valores de parámetros fueron motivados por un informe del grupo Nesmelov66, donde, a pesar de utilizar el método de administración de genes virales, infectaron las células en la etapa de mioblastos con una confluencia del 100% con una transición inmediata al medio de diferenciación, seguida de la recolección de los miotubos 7 días después. infección. Nuestros resultados muestran que, por un lado, la alta eficiencia de expresión esperada 24 h después de la transfección (nota de aplicación de JetPrime C2C12) se sacrificó (Fig. 1E) en favor de una formación de miotubos más rápida mediante la fusión de mioblastos. Por otro lado, la baja expresión en los primeros días después de la transfección juega a nuestro favor, ya que solo una pequeña fracción de la proteína expresada experimentaba un entorno intracelular no óptimo en términos de maquinaria de plegado adecuada. Es interesante observar cómo un área de transfección baja (<10%) en los días inmediatamente posteriores a la transfección se expandió posteriormente y tendió a alcanzar su punto máximo en los días 7 a 8 posteriores a la transfección. Lo más probable es que esto se deba a la transferencia horizontal de plásmido entre unos pocos mioblastos transfectados y los principales no transfectados (o transfectados con una expresión por debajo del límite de detección). Otra observación interesante es que este supuesto proceso de transferencia horizontal de genes se acelera si las células se siembran de manera que cerca del 100% de la confluencia se alcance primero dentro de las 36 a 48 h posteriores a la siembra, en lugar de si las células se siembran a una densidad más alta para llegar a la confluencia ya después de 24 h (como es la forma habitual). Se puede especular que los contactos célula-célula establecidos espontáneamente durante tiempos de crecimiento prolongados antes de la transfección son importantes para la fusión acelerada de mioblastos, la transferencia horizontal de plásmidos y la eficiencia general de la transfección (Fig. 1D). Curiosamente, en informes publicados recientemente también se realizó la recolección de células el día 7, después de la introducción del gen, utilizando la transferencia de genes virales a mioblastos53,66,68. No obstante, en el futuro se podrán considerar períodos de expresión más largos. Así, en un informe reciente sobre transfección viral, las células se recolectaron entre 9 y 11 días después de la infección de mioblastos, lo que dio como resultado un notable rendimiento de construcción similar a HMM de miosina β-cardíaca purificada de hasta 262 µg por placa de cultivo celular de 150 mm69 en comparación con 33 µg con cosecha después de 7 días53.

En nuestro protocolo, no cotransfectamos, ni intercambiamos posteriormente, cadenas ligeras murinas copurificadas con cadenas cardíacas humanas, como se hace generalmente en los laboratorios Spudich/Ruppel35,36 y Leinwand33,70. En cambio, el MHC beta-cardíaco humano se purifica junto con las cadenas ligeras murinas. Esto es similar a la mayoría de los otros protocolos anteriores que se basan en la administración de genes basados ​​en virus53,65,68,69. En un estudio, Swenson et al.53 identificaron completamente las cadenas ligeras murinas y descubrieron que constan de dos isoformas esenciales (músculo esquelético Myl1, Myl4 auricular/fetal) y una isoforma reguladora (músculo esquelético Mylpf). En otro estudio en el que se expresó y purificó una construcción similar a HMM de miosina β-cardíaca humana utilizando células C2C12, se observó una tercera isoforma MLC1F65. La detección de diferentes cadenas ligeras refleja en parte diferentes longitudes de las regiones de unión de las cadenas ligeras en las diferentes construcciones del MHC, pero también puede sugerir diferencias en los estados celulares C2C12 entre diferentes laboratorios. Esto podría ser importante ya que el estado celular estaba relacionado con la variabilidad de las mediciones de la actividad de la miosina ATPasa obtenidas en un laboratorio71.

Nuestra preparación S1L es bastante pura como se indica en la Fig. 2B. Sin embargo, para lograr mejoras adicionales y evitar proteínas contaminantes menores, se pueden adoptar varios enfoques adicionales en el futuro. Por lo tanto, se podría utilizar una purificación adicional mediante cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, columna HiTrap Q HP33,35) para pulir el eluato. Alternativamente, se puede diseñar un sitio de restricción TEV entre la eGFP y la etiqueta FLAG para permitir cortar las construcciones unidas de las perlas de purificación. Utilizando este último enfoque, no sería necesaria la elución mediante unión competitiva del péptido FLAG. Evitar este paso probablemente eliminaría la contaminación con proteínas no específicas del lisado celular que podrían unirse a las perlas de purificación de resina FLAG y liberarse tras la elución. Finalmente, se puede utilizar una etiqueta de purificación superior (por ejemplo, HaloTag72). Sin embargo, eso no se ha intentado aquí, ya que nuestro objetivo es evitar cambios en el protocolo de purificación establecido más allá del método de administración de genes que es el foco principal de nuestro estudio.

El rendimiento de nuestro sistema de purificación y expresión basado en C2C12 libre de virus descrito es de hasta 0,08 µg de proteína homogénea por cada cm2 de células cultivadas. Esto es aproximadamente de 2 a 4 veces menor que los rendimientos informados de sistemas virales C2C12 que utilizan una construcción de miosina cardíaca similar53,54,55 y de 4 a 8 veces menor que lo informado para otras isoformas de miosina del músculo estriado de longitudes similares y que usan una etiqueta alternativa (His-tag). )34. El rendimiento también es de 8 a 21 veces menor (o de 6 a 17 veces en moles) que el informado recientemente para una construcción similar a la meromiosina cardíaca pesada (HMM)69. Se espera un menor rendimiento con la transfección no viral porque actualmente no existe una alternativa igualmente efectiva a la maquinaria de administración de genes de los virus. Sin embargo, lo más importante es que el rendimiento de proteína activa, utilizando nuestro método libre de virus, es suficiente para los ensayos de ATPasa en estado estacionario y de motilidad in vitro.

Claramente, el rendimiento de nuestro sistema de expresión a pequeña escala es demasiado bajo para permitir la caracterización completa de la función motora de la miosina mediante cinética transitoria o estudios estructurales utilizando, por ejemplo, crio-EM. La ampliación para permitir tales estudios haría que el método fuera prohibitivamente costoso debido al costo del reactivo de transfección en sí. Sin embargo, para la producción de S1L a pequeña escala, como se describe aquí, el método es más rentable y eficaz en términos de tiempo, así como más accesible en general, que el método basado en adenovirus. Esto sugiere una estrategia, por ejemplo para el estudio de una amplia gama de mutaciones, con 1. detección funcional inicial (utilizando ATPasa y ensayos de motilidad in vitro) de una amplia gama de mutaciones producidas a pequeña escala utilizando el presente método, posiblemente seguida de 2. selección de las mutaciones más interesantes para aumentar la producción de proteínas para permitir estudios estructurales y cinéticos bioquímicos transitorios. Esta última ampliación podría lograrse una vez que se haya seleccionado un número limitado de mutaciones, ya sea utilizando expresión transitoria basada en adenovirus u otro proceso bastante largo, concretamente la generación de líneas celulares estables27. Esto último puede ser útil si es interesante producir cantidades sustanciales de una construcción determinada repetidamente. Estas líneas celulares C2C12 estables pueden, tras un enriquecimiento adecuado, expresar grandes cantidades de proteínas. Debido a la menor sensibilidad a la eficiencia de transfección limitada, se utilizó un agente de transfección basado en liposomas no virales (lipofectina) en la generación de líneas celulares estables27.

Además de las estrategias consideradas anteriormente, también prevemos desarrollos que utilicen ensayos de molécula única para sustituir muchos de los análisis cinéticos bioquímicos transitorios. Estos avances, si fueran posibles de realizar, permitirían una caracterización bioquímica casi completa utilizando proteínas producidas mediante el actual método de expresión transitoria no viral. Además, en el futuro también se podrá aumentar el rendimiento y reducir el coste de la transfección no viral. Por tanto, para potenciar aún más la expresión, se pueden realizar ciertas adaptaciones del protocolo descrito. Actualmente, la diferenciación celular y la expresión de proteínas se realizan en un medio de diferenciación estándar que incluye un 2% de suero de caballo32,34,35. Sin embargo, se han implementado formulaciones de medios de expresión/diferenciación más ricas; más recientemente se ha utilizado con éxito un medio de diferenciación que incluye un 10 % de suero de caballo y un 1 % de suero bovino fetal53,69. Esta formulación puede potenciar potencialmente la expresión de proteínas también en nuestro sistema. De hecho, se ha descubierto que cantidades mínimas (p. ej., 1%) de suero bovino pueden ser cruciales para una alta eficiencia de expresión de proteínas73.

La actividad de los motores purificados se comprobó midiendo la ATPasa basal y activada por actina en condiciones de estado estacionario. Sorprendentemente, los parámetros medidos en estado estacionario, es decir, actividad basal sin actina (kbasal), actividad de ATPasa activada por actina (kcat) y KATPasa concuerdan muy bien con los valores informados recientemente (kbasal ~ 0,02 s-1, kcat ~ 8-9 s- 1, KATPasa ~ 70–80 µM) usando construcciones similares (S1L), copurificadas, como aquí, con cadenas ligeras de ratón pero usando transfección viral53,54,55 (Tabla S1; Fig. S4). Además, las velocidades de deslizamiento de los filamentos de actina obtenidas en nuestro estudio (1,5–1,8 µm/s) también están en el mismo rango que las observadas en los estudios mencionados (1,5–1,7 µm/s) (Tabla S1; Fig. S4).

Por otro lado, se encontraron parámetros cinéticos algo diferentes en estudios que utilizaron construcciones de miosina más cortas (sS11-808aa), que albergaban sólo cadenas ligeras cardíacas esenciales (no RLC) pero humanas35,59,60,71,74,75,76 o la Construcción de miosina aún más corta S11-787aa sin cadenas ligeras65. Estos estudios mostraron valores más bajos de los parámetros de actividad de la ATPasa activada por actina (kcat ~ 6 s-1, KATPasa ~ 40 µM) (Tabla S2, Fig. S4), excepto por la actividad de la ATPasa basal (kbasal ~ 0,02 s-1) que sigue siendo similar77. Además, las velocidades de los filamentos de actina que utilizaron estas construcciones más cortas fueron menores (~ 0,9 µm/s) que para S1L (Tabla S2, Fig. S4). Los valores más bajos de kcat en algunos de estos experimentos, utilizando transfección viral, se atribuyeron a la variabilidad entre los estados celulares C2C1271, lo que sugiere que puede ser prudente realizar experimentos en paralelo (que expresen proteínas tanto de tipo salvaje como mutadas) al analizar diferentes enfermedades que causan mutaciones de β-miosina cardíaca. Teniendo en cuenta los valores de KATPasa consistentemente más altos para S1L con cadenas ligeras murinas que para sS1 con ELC humano y velocidades de deslizamiento consistentemente más altas en el ensayo de motilidad in vitro, creemos que estos efectos reflejan verdaderas diferencias entre las construcciones sS1 y S1L en lugar de peculiaridades metodológicas. En apoyo de esta opinión, la construcción humana similar a β-miosina HMM copurificada con cadenas ligeras de ratón también muestra una velocidad similar de ~ 1,5 µm/s69. Se pueden considerar diferentes mecanismos detrás de las diferencias observadas. Como se señaló anteriormente, es probable que las diferentes longitudes del brazo de palanca de unión de la cadena ligera y las diferentes isoformas de la cadena ligera sean importantes a este respecto53. La mayor longitud del brazo de palanca en S1L en comparación con sS1 podría, en sí misma, explicar la mayor velocidad de deslizamiento78. Además, debido a que la velocidad de deslizamiento producida por S1L con cadenas ligeras murinas parece ser similar (después de la corrección de temperatura) a la observada en fibras musculares peladas de ventrículos humanos (con todas las cadenas ligeras y pesadas de miosina humana)63, no parece haber necesidad asumir efectos adicionales de las cadenas ligeras murinas frente a las humanas sobre la velocidad de planeo.

Sin embargo, es importante considerar, en este sentido, que otros estudios demuestran un efecto dramático de las isoformas de cadena ligera esenciales79,80 y reguladoras81,82 tanto en las propiedades cinéticas de la miosina ATPasa del músculo estriado como en las velocidades de deslizamiento de los filamentos de actina. Además, al realizar experimentos en paralelo, Tang y compañeros de trabajo55 observaron que las sustituciones de la cadena reguladora del ratón por la cadena ligera reguladora ventricular humana (sin intercambio del ELC del ratón; estudio 3.1 frente a 3.2 en la Tabla S2) demostraron una velocidad reducida de la KATPasa y del filamento de actina. en ~ 40% y ~ 15%, respectivamente (ver también Fig. S4). Para abordar más definitivamente las funciones de las diferentes cadenas ligeras sin otras complicaciones, todos los experimentos deben realizarse en condiciones similares bien definidas y con una caracterización completa de las isoformas de las cadenas ligeras. Teniendo en cuenta algunas variabilidades percibidas, como se analizó anteriormente, estos estudios parecen ser de interés en el futuro.

Presentamos un método de transfección, expresión transitoria y purificación de proteínas libre de virus para la producción de miosina del músculo estriado humano activo en cantidades suficientes para análisis bioquímicos y biofísicos. Estamos seguros de que eludir el paso de producción viral contribuirá a “democratizar” (cf.83) el sistema de purificación y expresión de miosina del músculo estriado humano, haciéndolo atractivo y asequible para una comunidad científica más amplia. Se esperaría que esto, a su vez, beneficiara enormemente tanto la velocidad como la calidad de los descubrimientos científicos que se basan en el uso de miosina del músculo estriado expresada y purificada. En esta etapa, las limitaciones del método son rendimientos de purificación más bajos en comparación con la administración de genes virales como se analizó anteriormente. Otra posible limitación podría ser el coste actual del reactivo JetPrime al realizar transfecciones celulares a gran escala (~ 15 €/placa de cultivo celular de 60 mm, según lo estimado a partir de la cotización del producto obtenida del distribuidor en Suecia, abril de 2022). Aunque un juicio justo sobre los costos requeriría una estimación del costo para un título viral comparable, aún puede ser válido decir que el método es el más apropiado para experimentos de escala baja y media para la caracterización rápida de una amplia gama de mutaciones diferentes en paralelo, utilizando niveles estables. Técnicas bioquímicas y biofísicas de estado y de molécula única. Cuando se requiere ampliar a otros métodos, particularmente la infección basada en adenovirus es más adecuada. Arriba proponemos una estrategia para combinar nuestro método con la producción de proteínas basada en adenovirus o la producción utilizando una línea celular estable. Sin embargo, en el futuro, lo más probable es que estén disponibles comercialmente nuevos reactivos de transfección adecuados para las células C2C12 con una rentabilidad posiblemente mejor. Además, se puede prever que el desarrollo de métodos de molécula única puede permitir una caracterización bioquímica más extensa que requiera sólo cantidades mínimas de proteína expresada.

La actina se purificó a partir de músculo obtenido de un conejo sacrificado, siguiendo un procedimiento aprobado por el Comité Ético Regional para Experimentos con Animales en Linköping, Suecia (ref. 17,088–2020). Inmediatamente antes de la eutanasia, el conejo fue anestesiado mediante una inyección intramuscular de 0,25 ml de Zoletil con principios activos: Zolazepam, 6 mg/kg; Tiletamina, 6 mg/kg y medetomidina, 0,6 mg/kg. Luego siguió la eutanasia, mediante inyección de 2 ml de pentobarbital (100 mg/ml) en una vena de la oreja. Todos los procedimientos fueron realizados por el veterinario de la Universidad Linnaeus. La actina se aisló de un solo conejo, debido a que las propiedades de la actina no fueron el foco del estudio. En cambio, fue importante la posible variabilidad entre la miosina de tres purificaciones de expresión diferentes en su interacción con la actina (ver más abajo).

Los plásmidos se diseñaron para contener el gen MYH7 humano (//www.uniprot.org/uniprot/P12883) para β-MHC humano y la secuencia de nucleótidos se optimizó para la expresión en el fondo del huésped C2C12 del músculo del ratón. El gen MYH7 de longitud completa se truncó para expresar lo que denominamos subfragmento 1: largo (S1L; residuos de aminoácidos 1 a 848 del β-MHC humano), clonado en un plásmido pcDNA-3.1 bajo el promotor CMV84, añadiendo un grabado de tabaco. Sitio de escisión de la proteasa del virus (TEV) antes de una etiqueta de proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) y una etiqueta FLAG (GenScript Biotech Corporation). En este artículo nos referimos a esta construcción como S1L-eGFP-FLAG β-cardíaco humano o simplemente S1L. Esta construcción tiene un dominio motor único pero contiene sitios de unión de cadenas ligeras esenciales y reguladoras.

A vial of the mouse myogenic C2C12 cell line (ATCC CRL 1772) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich, Germany, now Merck). The cell line has been derived by serial passage of primary cultures of adult thigh muscle after injury85. For routine culture, C2C12 cells were seeded at a density of 103 cells/cm2 (for 3 days growth) or 0.5 × 103 cells/cm2 (for 4 days growth). They were then grown in growth medium, GM [DMEM-high glucose no sodium pyruvate (Sartorius, Germany), 10% Fetal Bovine Serum (HyClone), 1% Antibiotic–Antimycotic solution (Gibco) and 2 mM L-glutamine (Sigma)] in polystyrene cell culture flasks or dishes (Sarstedt) at 37 °C in a humidified condition supplied with 5% CO2 (Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubator, Thermo Fisher). The cells were subcultured when the confluency was around 60–70%. Under our cell culture conditions, doubling time was estimated (2006)." href="/articles/s41598-023-30576-1#ref-CR86" id="ref-link-section-d344944533e1505">86 fueron 16 ± 2 h (media ± DE, n = 43).

Para la diferenciación miogénica, las células se cultivaron hasta una confluencia del 95% y el medio se reemplazó con medio de diferenciación, DM. El último medio contenía DMEM con alto contenido de glucosa (sin piruvato de sodio) (Sartorius), 2% de suero de caballo donante (HyClone), 1% de solución antibiótica-antimicótica (Gibco), 2 mM de L-glutamina (Sigma), 1% de MEM sin gluten. aminoácido esencial (Gibco), HEPES 25 mM (Gibco) e insulina 1 µM (Sigma-Aldrich, ahora Merck). Las células se diferenciaron hasta el día 7 reemplazándolas con MS fresca cada 24 h. En los experimentos solo se utilizaron células entre los números de paso 5 y 15.

La transfección transitoria de células C2C12 se realizó utilizando el kit de reactivos de transfección de ADN JetPrime® (PolyPlus-transfection® SA, Francia), denominado "reactivo JetPrime" en este documento. En este procedimiento, tomamos un punto de partida en el manual de aplicación del fabricante para células C2C12 pero optimizamos el protocolo para la expresión de proteínas a gran escala.

Para optimizar la eficiencia de la transfección, se sembraron mioblastos C2C12 a 8 x 104 células/pocillo en placas de 12 pocillos (Sarstedt) y se cultivaron durante ~ 24 h para alcanzar una confluencia del 70% antes de la transfección, a menos que se indique lo contrario. Se preparó una mezcla maestra de transfección mezclando 1,5 μg de ADN plasmídico (1 μg/μl) y 3 μl de reactivo JetPrime (proporción 1:2) en 100 μL de tampón JetPrime® (propiedad de PolyPlus-transfection® SA, Francia; “JetPrime buffer” a continuación) para cada pocillo, a menos que se indique lo contrario. La mezcla de transfección se añadió a las células gota a gota y se incubó a 37 °C durante 3,5 a 4 h. El proceso de transfección se detuvo reemplazando GM con 0,5 ml de DM después de lavar las células una vez con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; todo por pocillo). Como se mencionó anteriormente, la DM se cambió cada 24 h hasta el día 6. La eficiencia de transfección y expresión se analizó mediante microscopía de fluorescencia. En estudios, después de la expresión de S1L a lo largo del tiempo, se sembraron mioblastos C2C12 en 30 x 104 células en placas de cultivo individuales de 35 mm (diámetro) (Nunc, Thermo Scientific) y se cultivaron durante ~ 36 h para alcanzar una confluencia del 95% antes de la transfección. Para cada placa, se preparó una mezcla maestra de transfección mezclando 7,5 µg de ADN plasmídico y 15 µl de reactivo JetPrime (relación 1:2) en 200 µl de tampón JetPrime. La mezcla de transfección se añadió a las células gota a gota y se incubó a 37 °C durante 3,5 a 4 h. El proceso de transfección se detuvo reemplazando GM con 2 ml de DM después de lavar las células una vez con 2 ml de PBS (todo en un plato). Como se mencionó anteriormente, la DM se cambió cada 24 h hasta el día 8. La transfección y la eficiencia de expresión se analizaron diariamente (una placa por día) primero mediante microscopía de fluorescencia y luego, después de la recolección de las células, mediante transferencia Western.

Para la purificación de proteínas, se sembraron mioblastos C2C12 a 6 x 105 células/cm2 en placas de plástico de 60 mm de diámetro (Sarstedt) y se cultivaron durante ~ 36 h para alcanzar una confluencia del 95% antes de la transfección. Se preparó una mezcla maestra de transfección mezclando 11,25 μg de ADN plasmídico (1 μg/μl) y 22,5 μl de reactivo JetPrime (relación 1:2) en 500 μl de tampón JetPrime por cada placa de 60 mm. La mezcla de transfección se añadió a las células gota a gota y se incubó a 37 °C durante 3,5 a 4 h. El proceso de transfección se detuvo reemplazando GM con 5 ml de DM después de lavar las células una vez con 3 ml de PBS. Como se mencionó anteriormente, la DM se cambió cada 24 h hasta el día 7. Las células se recogieron el día 7. Después de enjuagar con 3 ml de PBS frío, las células se rasparon usando un raspador de células con 1 ml de PBS frío. Luego, las células se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se sedimentaron suavemente mediante centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se congeló rápidamente con nitrógeno líquido y se almacenó posteriormente a -80 °C.

La expresión de la construcción de miosina marcada con GFP se monitorizó y analizó en micrografías obtenidas mediante un microscopio de fluorescencia invertida (Axio Observer D1, Zeiss, Alemania) equipado con una lámpara de mercurio (HBO 103 W/2, Osram, Alemania) y usando un objetivo de 10X y Juego de filtros FITC. Se adquirieron micrografías de fluorescencia y de campo brillante utilizando una cámara EMCCD (C9100-12, fotónica Hamamatsu, controlada por el software HCImage dedicado) con un tiempo de exposición constante (150 ms) y una ganancia (100) con una profundidad de imagen de 8 bits. Las imágenes se adquirieron en diferentes intervalos después de la transfección hasta 8 días. La intensidad de la luz se mantuvo lo más baja posible mediante un atenuador FL discreto (Cat. # 423,647, Zeiss) mantenido en la posición 5 (transmisión ~ 20%) y la exposición celular a la luz de excitación se minimizó para evitar la fototoxicidad celular. Se adquirieron hasta seis micrografías de fluorescencia y de campo brillante por cada parámetro o pocillo/placa de cultivo celular de ubicaciones seleccionadas al azar. Para evitar sesgos de selección (selección involuntaria de áreas de alta fluorescencia), la nueva ubicación siempre se seleccionó bajo iluminación de campo brillante y se estudió exhaustivamente toda la muestra87. Si era necesario, el brillo y el contraste de la imagen se ajustaron en ImageJ (Imagen/Ajustar/Brillo/Contraste).

Dado que las células que expresan la construcción de miosina siempre fueron 100% confluentes en el momento de la obtención de imágenes, la eficiencia de la transfección se determinó como 1) la fracción del área fluorescente total adquirida en imágenes de fluorescencia y 2) la intensidad de fluorescencia (nivel medio de escala de grises) en esas áreas. . Tenga en cuenta que esto último sólo es comparable entre experimentos si la adquisición de imágenes se realiza en períodos cercanos, preferiblemente el mismo día, con horas de trabajo de lámpara comparables y la misma configuración del microscopio (adquisición). Para facilitar el análisis se escribió una macro en Imagej (Fiji) con un conjunto de funciones disponibles (donde “//” indica comentario):

//Restar fondo.run("Restar fondo…", "rolling = 50");

//Segmentación de imagen.setAutoThreshold("Oscuro predeterminado");setAutoThreshold("Oscuro predeterminado sin reinicio");setThreshold(4, 255);// Los valores de umbral deben adaptarse según la calidad de las imágenes.

//mide la fracción del área fluorescente total y el valor de gris medio. En la configuración de la función "Medir" es importante marcar "límite al umbral" box.run("Medir");

Para los experimentos en los que las imágenes se adquirieron el mismo día, la eficiencia de transfección (TE) se calculó como producto entre la fracción del área fluorescente total (A) y la intensidad de la fluorescencia (I): TE = A × I (unidades arbitrarias) para facilitar la comparación relativa. entre diferentes parámetros de transfección.

La proteína total obtenida de lisados ​​celulares o de proteínas purificadas se analizó mediante SDS-PAGE y Western blot. Para los aislados de proteínas totales, las células se lisaron en hielo durante 30 minutos utilizando tampón RIPA (NaCl 150 mM, EGTA 5 mM, Triton X-100 al 1%, SDS al 0,1%, Tris-HCl 25 mM, 1 x cóctel inhibidor de proteasa Roche) , bajo sonicación durante 30 s (limpiador ultrasónico Branson 2510-DTH). A esto le siguió una centrifugación a 17.949 × g (13.000 RPM) utilizando una centrífuga Eppendorf 5430R durante 10 minutos a 4 ℃. Luego, las muestras de proteínas se mezclaron con tampón de muestra no reductor Pierce™ LDS (ThermoFisher) junto con DTT 50 mM y se calentaron a 95 ℃ durante 5 minutos. La electroforesis se realizó en gel NuPAGE™ 4–12 % Bis-Tris (Thermofisher) a 90 V durante 45 minutos, y luego se aumentó a 140 V durante una hora en el tampón de funcionamiento NuPAGE™ MES SDS (ThermoFisher). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,2 µm utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (BioRad) a 1 A, 25 V durante 30 min. Después de la transferencia, la membrana se incubó en tampón de bloqueo al 0,2% (bloque EZ, Biological Industries) durante una hora, se lavó con tampón TBS-T (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1%, pH = 7,4-7,6). y luego se incubó durante la noche con anticuerpos anti-FLAG (ab1257, Abcam) a una dilución de 1:20.000 en tampón de bloqueo. La transferencia se lavó en tampón TBS-T y luego se incubó con anticuerpos anti-cabra de burro (ab6885, Abcam) diluidos en TBS-T a 1:20.000 durante una hora. Finalmente, la membrana se lavó con TBS-T y la transferencia se reveló utilizando el kit de sustrato quimioluminiscente NovexTMECL (ThermoFisher). Las imágenes se obtuvieron utilizando el sistema de imágenes en gel ChemiDoc XRS (Biorad).

La estrategia de purificación (composiciones tampón, etc.) se basó en un procedimiento descrito previamente32,35. Todos los tampones se desgasificaron antes de su uso en la purificación. El sedimento se resuspendió en tampón de lisis a pH 7,2 (imidazol 20 mM, pH 7,2, NaCl 100 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, ATP 3 mM, PMSF 1 mM, sacarosa al 10%, 0,5 % Tween-20 y 1 × cóctel de inhibidores de proteasa de Roche) y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Dounce con 50–70 golpes en hielo. Las células lisadas se centrifugaron utilizando el rotor de ángulo fijo MLA-80 en una ultracentrífuga Optima MAX-XP a 100.000 × g durante 1 h a 4 ° C con la adición de 1 a 2 mM de MgATP fresco justo antes de la centrifugación. El sobrenadante se incubó con gel de afinidad Anti-Flag resin® M2 (Sigma-Aldrich) en un tubo Eppendorf durante 1,5 h a 4 °C en un nutador, protegiéndolo de la luz y el aire envolviéndolo con papel de aluminio y parafilm. En este paso utilizamos de 20 a 40 µl de resina empaquetada por placa de 60 mm, dependiendo de la fluorescencia de las células transfectadas. Después de la incubación, las perlas con resina Anti-Flag se lavaron dos veces con 20–25 volúmenes de resina de tampón de lavado a pH 7,2 (imidazol 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, EGTA 1 mM). DTT, ATP 3 mM, sacarosa al 10%, 1 x cóctel inhibidor de proteasa de Roche) seguido de dos lavados sin la adición de ATP ni cóctel inhibidor de proteasa. La proteína se eluyó de las perlas usando tampón de elución a pH 7,2 (imidazol 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, sacarosa al 10% y 150 µg/ml de 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich)). El eluato se pasó por columnas Pierce Micro-Spin (Thermo Scientific) para eliminar las perlas residuales y luego se concentró usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5. Para las eluciones, se utilizaron tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de baja unión a proteínas (Thermo Scientific). La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 488 nm utilizando el coeficiente de extinción eGFP de 61.000 M-1 cm-1.

Todos los tampones y soluciones se desgasificaron antes del ensayo. La actividad de la construcción de miosina β-cardíaca expresada se determinó mediante un ensayo de ATPasa activada por actina acoplada a NADH en condiciones de estado estacionario88. El ensayo se llevó a cabo en tampón de ensayo de ATPasa (imidazol 10 mM, pH 7,5, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM y DTT 1 mM) a 23 ℃ midiendo la absorbancia a 340 nm usando un espectrofotómetro UV (UV-1800, Shimadzu) en el tiempo. -modo de escaneo durante 5 min. El aparato estaba equipado con un soporte de celda supermicro para contener una cubeta negra supermicro, con un rango de volumen de trabajo de 50 a 200 µl, lo que reduce efectivamente el volumen de la muestra necesaria. La actina F se purificó de los músculos del lomo de conejo y se dializó tres veces en tampón de ensayo desgasificado89. Se añadió faloidina (Merck) a la actina después de la diálisis en una concentración de 1,1 equimolar para estabilizar los filamentos. La mezcla de reacción se preparó directamente en la cubeta en tampón de ensayo diluyendo miosina hasta una concentración final de 50 nM con concentraciones variables de actina que oscilaban entre 0 y 100 µM junto con MgATP 2 mM y solución de cóctel de NADH (NADH 1,2 mM, 200 U/ ml de lactato deshidrogenasa, 500 U/ml de piruvato quinasa y fosfo(enol)piruvato 2,5 mM). La miosina ATPasa basal (kbasal) se midió con miosina a una concentración final de 70 a 150 nM sin filamentos de actina. Las trazas de absorbancia de la reacción en cada concentración de actina se representaron como recambio de ATP frente al tiempo y las pendientes (tasas de ATPasa) obtenidas se normalizaron a la concentración de miosina. Las velocidades de reacción normalizadas representadas frente al aumento de la concentración de actina siguieron una hipérbola rectangular y fueron ajustadas por la ecuación de estado estacionario de Briggs-Haldane.88

para obtener kcat y KATPase, así como una estimación ajustada de kbasal (V0) (GraphPad Prism v9). Los ensayos se realizaron utilizando tres preparaciones de proteínas individuales (n = 3).

La motilidad de los filamentos de actina producidos por la construcción S1L de miosina β-cardíaca expresada se evaluó utilizando un procedimiento de ensayo de motilidad in vitro estándar35,90. Los cubreobjetos se recubrieron con nitrocelulosa al 1% en acetato de amilo, se secaron al aire y se ensamblaron para formar una celda de flujo como se describió anteriormente91. Inicialmente, los cabezales motores no funcionales se separaron de los funcionales mediante la realización de una o dos purificaciones por afinidad para mejorar la fracción de filamentos móviles91. La purificación por afinidad se realizó mezclando la solución madre con la proteína expresada con filamentos de actina a una concentración (concentración de subunidad) 10 veces mayor que la concentración de S1L durante 5 minutos en hielo, seguido de la adición de MgATP 4 mM y la incubación en hielo durante 5 minutos. Luego, la mezcla se centrifugó a 244.900 x g (75.000 RPM) usando un rotor TLA 120.1 en la ultracentrífuga (Optima MAX-XP, Beckman Coulter) durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante que contenía los motores funcionales se usó para el ensayo. . Se desgasificó una solución de baja fuerza iónica (LISS, MOPS 10 mM, pH = 7,4 a 25 °C, MgCl2 1 mM, EGTA 0,1 mM) y se complementó adicionalmente con KCl 50 mM y DTT 1 mM para producir un tampón de lavado. La celda de flujo se recubrió con anticuerpos anti-GFP (MAB3580, Merck, diluido 6 veces en tampón de lavado) durante 2 minutos y luego se bloqueó con 1 mg/ml de BSA (2 minutos, preparado en tampón de lavado). La proteína S1L-eGFP-FLAG purificada por afinidad, diluida en tampón de lavado (≤ 325 nM; medida antes de la purificación por afinidad), se añadió a la celda de flujo con incubación durante 5 minutos. Los motores inactivos se bloquearon aún más mediante un "procedimiento de bloqueo de actina" como se describió anteriormente91. La actina F no fluorescente (500 nM), triturada en tampón de lavado mediante pipeteo, se incubó con ATP 2 mM durante 2 minutos (en tampón de lavado) seguido de un lavado dos veces con tampón de lavado. Finalmente, se agregaron filamentos de actina marcados con rodamina-faloidina a una concentración de 15 nM en tampón de lavado y se incubaron durante 2 minutos seguido de un lavado de un volumen. Finalmente, se añadió la solución de ensayo de motilidad. La solución de ensayo contenía LISS (ver arriba), KCl 45 mM, DTT 10 mM, metilcelulosa al 0,64% y MgATP 2 mM. También se complementó con mezclas para la regeneración de ATP (200 µg/ml de creatina fosfoquinasa (CPK), 2,5 mM de creatina fosfato (CP)) y eliminación de oxígeno (3 mg/ml de glucosa, 40 µg/ml de catalasa, 100 µg/ml de glucosa oxidasa). (GOX)). La fuerza iónica fue de 60 mM. Se registraron películas de deslizamiento del filamento de actina a 25 ± 1 ℃ utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axio Observer equipado con un objetivo de 63X (equipado con un calentador de objetivo), un juego de filtros Cy3 y una cámara EMCCD (C9100-12, fotónica Hamamatsu, controlada por HCImage). software) a 5 fotogramas/s y una profundidad de imagen de 16 bits. Las velocidades de deslizamiento se calcularon utilizando un programa MATLAB hecho a medida92. Las fracciones de filamentos móviles se determinaron utilizando ImageJ93,94.

Anteriormente se describe el ajuste de curvas para el análisis de la tasa de recambio de ATP activado por actina. No se realizó ninguna prueba de hipótesis estadística, pero se supone que los intervalos de confianza del 95% que no se superponen corresponden a diferencias estadísticamente significativas. El significado y origen de las medidas centrales (valores medios aritméticos) y las barras de error se describen en las leyendas de las figuras y en las Tablas.

No se realizaron cálculos del tamaño de la muestra antes de los experimentos ya que el objetivo principal no era demostrar diferencias en las variables observadas entre grupos o de un valor poblacional determinado. En cambio, el objetivo era probar el nivel de expresión de S1L y la funcionalidad de la proteína purificada junto con información sobre la variabilidad. Las definiciones de eventos aleatorios independientes (n) se dan en las leyendas de las figuras y en la Tabla 1.

Los análisis estadísticos, por ejemplo, cálculo de intervalos de confianza y ajuste de curvas, se realizaron utilizando el software Graph Pad Prism v. 9.2 (Graph Pad Software LLC).

La mayoría de los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria). Los datos adicionales generados o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. La secuencia de ADN que codifica el dominio motor de miosina cardíaca beta humana (S1L) generada durante el estudio actual está disponible en el depósito NCBI GenBank (parte de International Nucleotide Sequence Collaboration [INSDC]), con el número de acceso OQ092356.

Heissler, SM & Sellers, JR Adaptaciones cinéticas de miosinas para sus diversas funciones celulares. Tráfico https://doi.org/10.1111/tra.12388 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kollmar, M. & Muhlhausen, S. La expansión del repertorio de miosina coincide con la diversificación de eucariotas en la era mesoproterozoica. BMC evolución. Biol. 17, 211. https://doi.org/10.1186/s12862-017-1056-2 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Saúl, J. et al. Desarrollo de un proceso completo de producción de proteínas humanas. Ciencia de las proteínas. 23, 1123-1135. https://doi.org/10.1002/pro.2484 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNally, EM, Goodwin, EB, Spudich, JA & Leinwand, LA Coexpresión y ensamblaje de la cadena pesada y la cadena ligera de miosina en Escherichia coli. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 85, 7270–7273. https://doi.org/10.1073/pnas.85.19.7270 (1988).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Lozanne, A. & Spudich, JA Interrupción del gen de la cadena pesada de miosina de Dictyostelium mediante recombinación homóloga. Ciencia 236, 1086–1091. https://doi.org/10.1126/science.3576222 (1987).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Manstein, DJ, Ruppel, KM & Spudich, JA Expresión y caracterización de un fragmento funcional de cabeza de miosina en Dictyostelium discoideum. Ciencia 246, 656–658. https://doi.org/10.1126/science.2530629 (1989).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Fujita, H. y col. Caracterización de miosinas mutantes de Dictyostelium discoideum equivalentes a mutantes de miocardiopatía hipertrófica familiar humana: el nivel de fuerza molecular de las miosinas mutantes puede tener una implicación pronóstica. J.Clin. Investigando. 99, 1010-1015. https://doi.org/10.1172/Jci119228 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldwell, JT, Melkani, GC, Huxford, T. y Bernstein, SI Expresión transgénica y purificación de isoformas de miosina utilizando el sistema muscular de vuelo indirecto de Drosophila melanogaster. Métodos 56, 25–32. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2011.12.002 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Trybus, KM Regulación de miosinas expresadas del músculo liso truncado. Papel de la cadena ligera esencial y longitud de la cola. J. Biol. Química. 269, 20819–20822 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sweeney, HL, Straceski, AJ, Leinwand, LA, Tikunov, BA y Faust, L. Expresión heteróloga de una miosina cardiomiopática que es defectuosa en su interacción con actina. J. Biol. Química. 269, 1603–1605 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Henn, A. & De La Cruz, EM La miosina VIIb de vertebrados es un motor de alta relación de trabajo adaptado para generar y mantener tensión. J. Biol. Química. 280, 39665–39676. https://doi.org/10.1074/jbc.M507667200 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ohki, T., Mikhailenko, SV, Arai, T., Ishii, S. & Ishiwata, S. Mejora de los rendimientos de actina recombinante y miosina V-HMM en el sistema de células de insecto/baculovirus mediante la adición de nutrientes al alto -cultivo celular de densidad. J. Res. muscular. Móvil celular. 33, 351–358. https://doi.org/10.1007/s10974-012-9323-8 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, M. y col. Control remoto de motores de miosina y kinesina mediante cambios de marchas activados por luz. Nat. Nanotecnología. 9, 693–697. https://doi.org/10.1038/nnano.2014.147 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haraguchi, T. y col. Descubrimiento de la miosina ultrarrápida, su secuencia de aminoácidos y características estructurales. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos https://doi.org/10.1073/pnas.2120962119 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Collins, K. y Matsudaira, PT Expresión recombinante de la cadena pesada de miosina I del borde en cepillo. Móvil celular. Citoesqueleto. 32, 151–161. https://doi.org/10.1002/cm.970320216 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Usaj, M. et al. Sobreexpresión y purificación de miosinas humanas a partir de células HEK293SF-3F6 adaptadas a suspensión transfectadas de forma transitoria y estable. Anal. Bioquímica. 558, 19-27. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.07.026 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rindt, H., Bauer, BJ y Robbins, J. Producción in vitro de cadena pesada de miosina enzimáticamente activa. J. Res. muscular. Móvil celular. 14, 26–34. https://doi.org/10.1007/BF00132177 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Moncman, CL, Rindt, H., Robbins, J. y Winkelmann, DA Ensamblaje segregado de miosina muscular expresada en células no musculares. Mol. Biol. Celda 4, 1051–1067. https://doi.org/10.1091/mbc.4.10.1051 (1993).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sata, M. & Ikebe, M. Análisis funcional de las mutaciones en la betamiosina cardíaca humana que son responsables de la miocardiopatía hipertrófica familiar. Implicación para el resultado clínico. J.Clin. Invertir. 98, 2866–2873. https://doi.org/10.1172/jci119115 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, MG, Landsverk, ML, Barral, JM y Epstein, HF Dos isoformas UNC-45 de mamíferos están relacionadas con distintas funciones citoesqueléticas y específicas de los músculos. J. Ciencia celular. 115, 4013–4023. https://doi.org/10.1242/jcs.00108 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Barral, JM, Bauer, CC, Ortiz, I. y Epstein, HF Las mutaciones Unc-45 en Caenorhabditis elegans implican un dominio similar a CRO1/She4p en el ensamblaje de miosina. J. Biol celular. 143, 1215-1225. https://doi.org/10.1083/jcb.143.5.1215 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barral, JM, Hutagalung, AH, Brinker, A., Hartl, FU y Epstein, HF Papel de la proteína de ensamblaje de miosina UNC-45 como acompañante molecular de la miosina. Ciencia 295, 669–671. https://doi.org/10.1126/science.1066648 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Melkani, GC, Bodmer, R., Ocorr, K. y Bernstein, SI La chaperona UNC-45 es fundamental para establecer la organización miofibrilar basada en miosina y la contractilidad cardíaca en el modelo de corazón de Drosophila. MÁS UNO 6, e22579. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022579 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hellerschmied, D. y col. Características moleculares de la chaperona UNC-45 fundamentales para unir y plegar la miosina muscular. Nat. Comunitario. 10, 4781. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12667-8 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Glazier, AA y col. HSC70 es un acompañante de la proteína C de unión a miosina cardíaca mutante y de tipo salvaje. JCI Insight 3, e99319 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Srikakulam, R. & Winkelmann, DA El plegamiento de la miosina II está mediado por una chaperonina molecular. J. Biol. Química. Rev. 274, 27265–27273. https://doi.org/10.1074/jbc.274.38.27265 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kinose, F., Wang, SX, Kidambi, US, Moncman, CL y Winkelmann, DA La glicina 699 es fundamental para la actividad motora de la miosina del músculo esquelético. J. Biol celular. 134, 895–909 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chow, D., Srikakulam, R., Chen, Y. y Winkelmann, DA Plegado del dominio motor de miosina del músculo estriado. J. Biol. Química. 277, 36799–36807. https://doi.org/10.1074/jbc.M204101200 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Srikakulam, R. & Winkelmann, DA Plegado y ensamblaje de miosina en el músculo estriado mediado por chaperona. J. Ciencia celular. 117, 641–652. https://doi.org/10.1242/jcs.00899 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, J. Manual de microbiología y biotecnología industrial 3ª ed. (Sociedad Estadounidense de Microbiología, 2010).

Google Académico

Wang, Q., Moncman, CL y Winkelmann, DA Las mutaciones en el dominio motor modulan la actividad de la miosina y la organización de las miofibrillas. J. Ciencia celular. 116, 4227–4238. https://doi.org/10.1242/jcs.00709 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Resnicow, DI, Deacon, JC, Warrick, HM, Spudich, JA y Leinwand, LA Diversidad funcional entre una familia de motores de miosina del músculo esquelético humano. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 107, 1053–1058. https://doi.org/10.1073/pnas.0913527107 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Deacon, JC, Bloemink, MJ, Rezavandi, H., Geeves, MA y Leinwand, LA Identificación de diferencias funcionales entre motores de miosina cardíaca α y β humanos recombinantes. Celúla. Mol. Ciencias de la vida. 69, 2261–2277. https://doi.org/10.1007/s00018-012-0927-3 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bloemink, MJ, Deacon, JC, Resnicow, DI, Leinwand, LA y Geeves, MA La miosina extraocular humana ultrarrápida es cinéticamente distinta de las isoformas esqueléticas rápidas IIa, IIb y IId. J. Biol. Química. 288, 27469–27479. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.488130 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommese, RF y cols. Consecuencias moleculares de la mutación de la miocardiopatía hipertrófica R453C en la función motora de la miosina beta-cardíaca humana. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 110, 12607–12612. https://doi.org/10.1073/pnas.1309493110 (2013).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. y col. La mesa de miosina y la base de la hipercontractilidad causada por mutaciones en la miocardiopatía hipertrófica. Nat. Estructura. Mol. Biol. 24, 525–533. https://doi.org/10.1038/nsmb.3408 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kovesdi, I. & Hedley, SJ Células productoras de adenovirus. Virus 2, 1681-1703. https://doi.org/10.3390/v2081681 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dumitrescu, M., Trusca, VG, Fenyo, IM y Gafencu, AV Un método eficaz para la producción de adenovirus. JOVE 74, e61691. https://doi.org/10.3791/61691 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Él, TC et al. Un sistema simplificado para generar adenovirus recombinantes. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 95, 2509–2514. https://doi.org/10.1073/pnas.95.5.2509 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, TK y Eberwine, JH Transfección de células de mamíferos: el presente y el futuro. Anal. Bioanal. Química. 397, 3173–3178. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F. y Christensen, G. Comparación de la transfección no viral y la transducción viral adenoasociada en cardiomiocitos. Mol. Biotecnología. 28, 21–32. https://doi.org/10.1385/MB:28:1:21 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Balci, B. & Dinçer, P. Transfección eficiente de mioblastos C2C12 derivados de ratón utilizando una matriz de membrana basal matrigel. Biotecnología. J. 4, 1042–1045. https://doi.org/10.1002/biot.200800269 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fernández-Puente, E. et al. Expresión y análisis funcional de los biosensores de peróxido de hidrógeno HyPer y HyPer2 en mioblastos/miotubos C2C12 y fibras individuales de músculo esquelético. Ciencia. Rep. 10, 871. https://doi.org/10.1038/s41598-020-57821-1 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dodds, E., Dunckley, MG, Naujoks, K., Michaelis, U. y Dickson, G. Lipofección de células musculares de ratón cultivadas: una comparación directa de Lipofectamine y DOSPER. Gene Ther. 5, 542–551. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300604 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yamano, S., Dai, J. y Moursi, AM Comparación de la eficiencia de transfección de reactivos de transferencia de genes no virales. Mol. Biotecnología. 46, 287–300. https://doi.org/10.1007/s12033-010-9302-5 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Goullee, H. y col. Edición mejorada del gen CRISPR/Cas9 en mioblastos humanos primarios utilizando cultivos de baja confluencia en Matrigel. Esqueleto. Músculo 11, 1–13 (2021).

Artículo de Google Scholar

Vitiello, L., Bockhold, K., Joshi, PB y Worton, RG Transfección de mioblastos cultivados en alta concentración sérica con liposomas DODAC:DOPE. Gene Ther. 5, 1306-1313. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300729 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Quenneville, SP y cols. Nucleofección de células madre derivadas de músculos y mioblastos con integrasa phiC31: expresión estable de un gen de fusión de distrofina de longitud completa por mioblastos humanos. Mol. El r. 10, 679–687. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.05.034 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Manabe, Y. et al. Caracterización de un modelo de contracción muscular aguda utilizando miotubos C2C12 cultivados. MÁS UNO 7, e52592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052592 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potočnik, T., Sachdev, S., Polajžer, T., Maček Lebar, A. & Miklavčič, D. Transfección genética eficiente mediante electroporación & mdash; Estudio in vitro e in silico de los parámetros del pulso. Aplica. Ciencia. 12, 8237 (2022).

Artículo de Google Scholar

Cristina, E. y col. Polietilenimina, un reactivo de transfección rentable. Transducción de señales. 6, 179–184. https://doi.org/10.1002/sita.200500073 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Jiang, P., Ren, L., Zhi, L., Hu, X. y Xiao, Protocolo RP para la preparación celular y la administración de genes en células HEK293T y C2C12. Protocolo estelar. 2, 100497. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100497 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swenson, AM y cols. Omecamtiv mecarbil mejora la relación de trabajo de la miosina betacardíaca humana, lo que da como resultado una mayor sensibilidad al calcio y un desarrollo de fuerza más lento en el músculo cardíaco. J. Biol Chem. 292, 3768–3778. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.748780 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W., Unrath, WC, Desetty, R. y Yengo, CM La mutación de la miocardiopatía dilatada en el dominio convertidor de la miosina cardíaca humana altera la actividad motora y la respuesta al omecamtiv mecarbil. J. Biol. Química. 294, 17314–17325. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010217 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W., Ge, J., Unrath, WC, Desetty, R. y Yengo, CM Las mutaciones de la miocardiopatía afectan el golpe de potencia activado por actina de la miosina cardíaca humana. Biofísica. J. 120, 2222–2236. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.04.007 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsh, R., Rutland, C., Thomas, R. y Loughna, S. Cardiomiopatía: una revisión sistemática de las mutaciones que causan enfermedades en la cadena pesada 7 de la miosina y sus manifestaciones fenotípicas. Cardiología 115, 49–60. https://doi.org/10.1159/000252808 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ochala, J. & Sun, YB Nuevas terapias basadas en miosina para miopatías cardíacas y esqueléticas congénitas. J. Med. Gineta. 53, 651–654. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2016-103881 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Parker, F. y Peckham, M. Mutaciones de enfermedades en miosinas del músculo estriado. Biofísica. Apocalipsis 12, 887–894. https://doi.org/10.1007/s12551-020-00721-5 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. y col. Los parámetros de contractilidad de la miosina betacardíaca humana con la mutación R403Q de la miocardiopatía hipertrófica muestran pérdida de la función motora. Ciencia. Adv. 1, e1500511. https://doi.org/10.1126/sciadv.1500511 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar, SS y cols. Las mutaciones R403Q y R663H de la miocardiopatía hipertrófica aumentan el número de cabezas de miosina disponibles para interactuar con la actina. Ciencia. Adv. 6, eaax0069 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda, TQP, Kron, SJ y Spudich, JA Tamaño del paso de miosina: estimación a partir del movimiento deslizante lento de actina sobre densidades bajas de meromiosina pesada. J. Mol. Biol. 214, 699–710. https://doi.org/10.1016/0022-2836(90)90287-V (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Walcott, S., Warshaw, DM y Debold, EP El acoplamiento mecánico entre moléculas de miosina provoca diferencias entre las mediciones de conjunto y de molécula única. Biofísica. J. 103, 501–510. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.06.031 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blair, CA y cols. La insuficiencia cardíaca en humanos reduce la fuerza contráctil en el miocardio de ambos ventrículos. Traducción básica JACC. Ciencia. 5, 786–798. https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2020.05.014 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, J. y col. DOG 1.0: Ilustrador de estructuras de dominios de proteínas. Resolución celular. 19, 271–273. https://doi.org/10.1038/cr.2009.6 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Winkelmann, DA, Forgacs, E., Miller, MT y Stock, AM Base estructural de los cambios alostéricos inducidos por fármacos en la actividad motora de la miosina beta-cardíaca humana. Nat. Comunitario. 6, 7974 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A., Ge, J., Tkachev, YV y Nesmelov, YE Las interacciones electrostáticas en la región generadora de fuerza de la miosina cardíaca humana modulan la disociación del ADP de la actomiosina. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 509, 978–982. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.01.045 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woody, MS, Winkelmann, DA, Capitanio, M., Ostap, EM y Goldman, YE La mecánica de una sola molécula resuelve los primeros eventos en la generación de fuerza por la miosina cardíaca. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.49266 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A., Iragavarapu, SB, Grdzelishvili, AV y Nesmelov, YE Las interacciones electrostáticas en la hélice SH1-SH2 de la miosina cardíaca humana modulan el tiempo de unión fuerte de la actomiosina. J. Res. muscular. Móvil celular. 42, 137–147. https://doi.org/10.1007/s10974-020-09588-1 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Snoberger, A. y col. La miosina con mutación cardíaca hipertrófica R712L tiene una carrera de trabajo disminuida que es rescatada por omecamtiv mecarbil. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.63691 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Vera, CD y cols. Los dominios motores de miosina que portan mutaciones implicadas en la miocardiopatía hipertrófica de aparición temprana o tardía tienen propiedades similares. J. Biol. Química. 294, 17451–17462. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010563 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawana, M., Sarkar, SS, Sutton, S., Ruppel, KM y Spudich, JA Propiedades biofísicas de la miosina β-cardíaca humana con mutaciones convertidoras que causan miocardiopatía hipertrófica. Ciencia. Adv. 3, e1601959. https://doi.org/10.1126/sciadv.1601959 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ohana, RF y cols. Purificación basada en HaloTag de quinasas humanas funcionales a partir de células de mamíferos. Expresión de proteínas. Purif. 76, 154-164 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Pham, PL y cols. Transfección transitoria a gran escala de células HEK293 EBNA1 en crecimiento en suspensión sin suero: los aditivos de peptona mejoran el crecimiento celular y la eficiencia de la transfección. Biotecnología. Bioeng. 84, 332–342. https://doi.org/10.1002/bit.10774 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Adhikari, AS et al. Las mutaciones de miocardiopatía hipertrófica de inicio temprano aumentan significativamente la velocidad, la fuerza y ​​la actividad ATPasa activada por actina de la miosina β-cardíaca humana. Representante celular 17, 2857–2864. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.11.040 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aksel, T., Choe, Yu. E., Sutton, S., Ruppel, KM y Spudich, JA Cambios de fuerza en conjunto que resultan de mutaciones de la miosina cardíaca humana y un efector de molécula pequeña. Representante celular 11, 910–920. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.04.006 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ujfalusi, Z. et al. Los mutantes de miosina en miocardiopatía dilatada tienen una capacidad de generación de fuerza reducida. J. Biol. Química. 293, 9017–9029. https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.001938 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anderson, RL y cols. Descifrando el estado súper relajado de la miosina beta-cardíaca humana y el modo de acción del mavacamten desde las moléculas de miosina hasta las fibras musculares. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 115, E8143 – E8152. https://doi.org/10.1073/pnas.1809540115 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda, TQ, Abramson, PD y Spudich, JA La región del cuello del dominio motor de miosina actúa como un brazo de palanca para generar movimiento. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 93, 4459–4464. https://doi.org/10.1073/pnas.93.9.4459 (1996).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, TB y cols. La miosina ventricular cardíaca y la miosina esquelética lenta exhiben propiedades quimiomecánicas diferentes a pesar de tener la misma isoforma de cadena pesada de miosina. J. Biol. Química. 298, 748. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102070 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Osten, J. y col. La cadena ligera esencial de miosina 1sa desacelera el deslizamiento de actina y filamentos finos sobre las moléculas de beta-miosina. J. Gen. Physiol. https://doi.org/10.1085/jgp.202213149 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Amrute-Nayak, M. et al. Transformación de la miosina II esquelética rápida no procesiva en un motor procesivo. Pequeño 15, 1804313 (2019).

Artículo de Google Scholar

Nayak, A. et al. El análisis de una sola molécula revela que las cadenas ligeras reguladoras afinan la función de la miosina II esquelética. J. Biol. Química. 295, 7046–7059. https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.012774 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ambrose, B. y col. democratizando FRET de una sola molécula: un microscopio de código abierto para medir distancias precisas y dinámica biomolecular. Biofísica. J. 118, 614a (2020).

ADS del artículo Google Scholar

MacColl, GS y cols. Optimización de la producción de la hormona del crecimiento por parte de las células musculares utilizando ADN plasmídico. J. Endocrinol. 165, 329–336. https://doi.org/10.1677/joe.0.1650329 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yaffe, D. & Saxel, O. Una línea celular miogénica con requisitos séricos alterados para la diferenciación. Diferenciación 7, 159-166. https://doi.org/10.1111/j.1432-0436.1977.tb01507.x (1977).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roth, V. Computación del tiempo de duplicación, (2006).

Lee, JY y Kitaoka, M. Una guía para principiantes sobre el rigor y la reproducibilidad en experimentos de imágenes de fluorescencia. Mol. Biol. Celda 29, 1519-1525. https://doi.org/10.1091/mbc.E17-05-0276 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De La Cruz, EM & Ostap, EM Análisis cinético y de equilibrio de la miosina ATPasa. Métodos Enzimol. 455, 157–192. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(08)04206-7 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pardee, JD & Spudich, JA Purificación de actina muscular. Métodos Enzimol. 85, 164–181. https://doi.org/10.1016/0076-6879(82)85020-9 (1982).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kron, SJ, Toyoshima, YY, Uyeda, TQ y Spudich, JA Ensayos para el movimiento deslizante de actina sobre superficies recubiertas de miosina. Métodos Enzimol. 196, 399–416. https://doi.org/10.1016/0076-6879(91)96035-p (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rahman, MA, Salhotra, A. & Mansson, A. Análisis comparativo de métodos ampliamente utilizados para eliminar cabezas de miosina no funcionales para el ensayo de motilidad in vitro. J. Res. muscular. Móvil celular. 39, 175–187. https://doi.org/10.1007/s10974-019-09505-1 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mansson, A. & Tagerud, S. Estadística multivariada en el análisis de datos del ensayo de motilidad in vitro. Anal. Bioquímica. 314, 281–293. https://doi.org/10.1016/s0003-2697(02)00610-3 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schindelin, J. y col. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Métodos Nat 9, 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Abramoff, M., Magalhães, P. & Ram, SJ Procesamiento de imágenes con imageJ. Biofotónica Int. 11, 36–42 (2003).

Google Académico

Descargar referencias

Este trabajo fue financiado por el Programa Marco de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención 732482) (Tecnologías futuras y emergentes; Bio4comp), el Consejo de Investigación Sueco (números de subvención 2015-05290 y 2019-03456) y la Facultad de Ciencias de la Salud y la Vida de la Universidad Linnaeus, Suecia. Este estudio se inició durante un año sabático de A Månsson en el laboratorio de JA Spudich en la Universidad de Stanford. El año sabático fue cofinanciado por la fundación Wenner-Green y la Facultad de Ciencias de la Salud y la Vida de la Universidad Linnaeus. El progreso del trabajo también se basa en una visita de investigación del Dr. L. Moretto al laboratorio de los Dres. Spudich y KC Ruppel, financiada por la Facultad de Ciencias de la Salud y la Vida de la Universidad Linnaeus. Además, agradecemos a los Dres. Spudich y Ruppel por brindar generosamente protocolos clave y por importantes consejos y debates durante el curso del estudio. Además, se reconoce a la Dra. Linda Song por sus debates y consejos. Finalmente, agradecemos al profesor Spudich por leer y comentar el manuscrito.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad Linnaeus.

Estos autores contribuyeron por igual: Lok Priya Velayuthan y Luisa Moretto.

Departamento de Química y Ciencias Biomédicas, Universidad Linnaeus, 391 82, Kalmar, Suecia

Lok Priya Velayuthan, Luisa Moretto, Sven Tågerud, Marko Ušaj y Alf Månsson

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

LPV: Análisis formal, Metodología, Investigación, Redacción-Preparación de borrador original, Visualización, Redacción-Revisión y Edición. LM: Análisis formal, Metodología, Investigación, Redacción-Preparación del borrador original, Redacción-Revisión y edición. ST: Conceptualización, Metodología, Redacción-Revisión y Edición. MU: Conceptualización, Análisis formal, Validación, Curación de datos, Metodología, Investigación, Redacción-preparación del borrador original, Supervisión, Redacción-Revisión y Edición. AM: Conceptualización, Validación, Curación de datos, Metodología, Investigación, Redacción-preparación del borrador original, Supervisión, Redacción-Revisión y edición, Adquisición de fondos. Todos los autores han aprobado la versión enviada.

Correspondencia a Marko Ušaj o Alf Månsson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Vídeo complementario 1.

Vídeo complementario 2.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Velayuthan, LP, Moretto, L., Tågerud, S. et al. Transfección, expresión transitoria y purificación sin virus de miosina cardíaca humana en células musculares de mamíferos para ensayos bioquímicos y biofísicos. Representante científico 13, 4101 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

Descargar cita

Recibido: 07 de diciembre de 2022

Aceptado: 27 de febrero de 2023

Publicado: 12 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.